南极鱼亚目(Notothenioidei)鱼类在南极由温暖变成寒冷的气候演变过程中进化而来,适应了极端寒冷和长期黑暗的环境,从一个底栖、温带的原始祖先,适应性地扩张到南极海域的各个水层,成为今天在这个特殊环境中占绝对优势的物种。南极鱼亚目鱼类在几千万年的进化过程中受到长期低温,以及各种环境微生物和病原微生物的选择压力,其肠道和皮肤黏液微生物菌落与宿主共同进化,可能会形成一些特有的组分和功能。目前对南极鱼肠道和黏液微生物的研究稀少。鉴于此,加强对南极鱼类消化道、体表黏液微生物及其与环境微生物的关系研究,不仅能丰富我们对鱼类肠道和体表微生物的认识,阐明温度和微生物菌群对鱼类适应性进化的影响,而且对预测全球气候变化对南极鱼类适应的影响有重要意义。本研究从以下4个方面进行开展:首先对2010年至2018年采集的20条独角雪冰鱼(Chionodraco hamatus)肠道微生物和其生活附近罗斯海水域的环境微生物进行研究。通过16S r RNA基因高通量测序,鉴定和比较了鱼肠道和环境微生物群落的差异以及预测微生物功能,有以下发现:1)C.hamatus肠道微生物共有443个属,罗斯海海水有609个属。α多样性结果显示两者微生物多样性有显著性差异。香农指数和辛普森指数结果都显示水环境微生物多样性比C.hamatus肠道微生物菌群丰富。在C.hamatus肠道中主要是变形菌门(Proteobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)、厚壁菌门(Firmicutes)等;在环境中除了变形菌门外,蓝藻(Cyanobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)也占比较多。2)水环境微生物与C.hamatus肠道微生物群落结构不同,非度量多维尺度分析(Non-metric multidimensional scaling analysis,NMDS)显示C.hamatus肠道和水环境微生物菌群为明显的两簇。并且对C.hamatus、虹鳟、鲤鱼的肠道和罗斯海水环境微生物进行比较,发现C.hamatus肠道微生物丰度比鲤鱼低,NMDS分析结果显示在OTU和属水平上,三种鱼的肠道微生物不同,表明肠道微生物受宿主选择,明显区别于环境微生物。3)进一步在时间对C.hamatus肠道微生物的影响研究中发现,2016、2017和2018年3个不同时间采集的C.hamatus肠道菌群结构不同。4)功能预测发现含量最多的是能量和代谢功能。KEGG通路的分析显示主要富集到与代谢、遗传信息处理和环境信息处理相关的功能,暗示适应极端寒冷环境可能是多个功能/通路相互作用的结果。其次对2017年至2018年南极圈内的中山站、罗斯海和南极圈外的长城站等不同地理位置采集的南极鱼肠道和皮肤黏液微生物群落进行研究。对采集的南极鱼进行不同位置、不同时间、LPS注射、高温刺激等进行分组。发现以下结果:1)罗斯海和中山站的独角雪冰鱼(C.hamatus)和伯氏肩孔南极鱼(T.bernacchii)两种代表性鱼类与长城站的革首南极鱼(N.coriiceps)和花纹南极鱼(N.rossii)肠道微生物群落结构不同,且不同地理位置的南极鱼亚目鱼类的肠道和皮肤黏液微生物的丰度有显著性差异。假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)在罗斯海和中山站的C.hamatus、T.bernacchii肠道和皮肤黏液中含量较多,Aliivibrio、发光杆菌属(Photobacterium)和鲸杆菌属(Cetobacterium)在长城站的N.coriiceps和N.rossii肠道中较丰富,科维尔氏菌属(Colwellia)和Psychromonas则在长城站的N.coriiceps和N.rossii皮肤黏液中有较多表达。2)不管是对照组还是实验组(温度处理组、注射LPS组),罗斯海、中山站和长城站的南极鱼亚目鱼类肠道和皮肤黏液微生物都明显分为两部分,表明地理位置对微生物的分布有重要影响。3)2017年12月上旬和2018年1月下旬至2月上旬采集的罗斯海和中山站的鱼肠道微生物群落不同,NMDS分析显示C.hamatus和T.bernacchii两种鱼的肠道微生物分为2017年和2018年两组,但两种鱼的肠道微生物没有明显区别。表明时间对南极鱼肠道微生物群落组成有重要影响。4)LPS注射刺激T.bernacchii 12小时,肠道微生物多样性升高,然后逐渐降低,至72小时,约是对照组的72%。南极长城站N.coriiceps和N.rossii肠道和皮肤黏液微生物在LPS注射后,多样性降低。对N.rossii进行升温刺激,发现温度升高也会降低其微生物多样性,且肠道微生物群落组成变化较大。高温和LPS注射同时刺激N.rossii,发现其肠道菌群多样性约为正常组的45%,皮肤黏液微生物多样性约为对照组的67%,表明LPS注射和高温会降低肠道和皮肤黏液微生物的多样性,两者共同刺激会显著降低微生物种群多态性。在氧气变化对T.bernacchii肠道和皮肤黏液微生物群落的影响研究中发现,肠道微菌群对氧气更敏感,将其暴露于空气中,肠道菌群显著增加,而皮肤黏液微生物变化不大,暗示肠道微生物可能在宿主氧气代谢通路方面有重要作用。5)对C.hamatus、T.bernacchii等肠道和黏液微生物进行宏基因组测序,KEGG功能注释结果显示,肠道微生物功能主要富集在氧化磷酸化和神经退行性疾病,黏液微生物功能主要富集在钙信号通路、c GMP-PKG信号通路等环境信息处理,表明能量产生、保存和对环境信息处理的功能在南极亚目鱼类适应南极寒冷环境方面有重要作用。接着对2018年1月至2月采集的38个罗斯海海水样本进行环境微生物研究。发现:1)罗斯海水中共有45个门,其中变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、蓝藻和放线菌门含量最多,Epsilonbacteraeota、软壁菌门、Patescibacteria和Rokubacteria在罗斯海海水微生物中含量较少。2)不同水层的微生物群落变化较大,上层海水与深层海水微生物群落结构明显不同。在小于50米的上层海水中,蓝藻、变形菌门、拟杆菌门含量最多,在大于1000米的深层海水中,变形菌门最多,其次是厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门,表明水深对微生物的群落组成有影响。3)对微生物群落组成和环境因子的关系研究,显示一些细菌的生物含量与环境理化参数呈正相关,而另一些则与环境因子呈负相关,荧光度、电导率、温度、密度、盐度和深度等影响了许多细菌的分布。在门水平,蓝藻与荧光度和氧气显著正相关(P≤0.001),与盐度显著负相关。Chloroflexi和Acidobacteria与密度和盐度显著正相关,然而Patescibacteria、Spirochaetes和Chlamydiae分别与荧光度、氧气含量和温度显著的负相关。在属水平上,拟杆菌属和乳酸菌属与荧光度呈显著负相关,乳酸菌、Treponema＿2和Romboutsia与氧含量呈显著负相关,Norank＿f＿＿norank＿o＿＿Chloroplast、SAR92＿clade等对荧光度和氧气呈显著正相关,对电导率和深度呈显著负相关。Norank＿f＿＿Muribaculaceae与深度和盐度呈显著正相关,与荧光度呈显著负相关,表明环境理化因子对南极罗斯海海水微生物的分布有重要影响。4)进一步对相同海域的沉积物微生物和底层海水微生物研究,比较发现不同样品来源的微生物群落不同,底层海水比沉积物中的微生物多样性丰富,变形杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门在底层海水中占主导地位,而在沉积物微生物中,拟杆菌门和变形杆菌门含量最多,占比超过细菌总数的91%。NMDS分析显示罗斯海底层海水与沉积物微生物群落结构从物种水平到科水平都存在明显差异,表明样品来源对微生物的组成有重要影响。最后对采集的中山站海水与南北极不同位置水环境微生物群落进行比较研究。主要有以下发现:1)从5个中山站海水样本中共鉴定出733个OTU,237个属。在OTUs水平上5个样品有较大的变化,但在门水平上,差别不大。中山站海水中细菌前三个门(变形菌门、拟杆菌门和蓝藻)占了细菌总数的98.44%。在属水平上,黄杆菌属和嗜冷杆菌属占比都超过20%。2)从中山站和罗斯海上层海水的微生物群落结构比较中,发现罗斯海上层海水比中山站海水微生物多样性丰富,且主要菌群丰度不同,在中山站水样微生物中,黄杆菌属和嗜冷杆菌属最多,罗斯海上层海水微生物中norank＿f＿＿norank＿o＿＿Chloroplast和Polaribacter＿1含量丰富。β多样性分析结果显示,在OTU水平和物种水平上,两个地理位置的微生物群落结构不同。3)与西南极的南极半岛海水、北冰洋和挪威斯瓦尔巴群岛等南极和北极海水微生物比较,发现变形菌门、拟杆菌门和蓝藻在所有海水中普遍存在,且变形菌门为优势菌,蓝藻在南极海水中含量丰富,可能在维持南极海洋生态系统平衡方面有重要作用。NMDS结果显示南极(南极半岛西部、中山站和罗斯海上层海水)和北极(北冰洋和挪威斯瓦尔巴群岛)的海水微生物群落存在明显差异,表明地理位置对水环境微生物有重要影响。4)对中山站的海水微生物宏基因组KEGG功能注释结果显示,主要富集在氨基酸生物合成和碳代谢通路,暗示中山站海水可能在碳循环途径中有重要作用。