荧光定量PCR是近年来新发展起来的PCR新技术,为基因定量分析的发展起到了巨大的推动作用。现有的荧光定量PCR技术主要基于荧光能量传递技术[1](fluoresce nceresonance energy transfer, FRET)而发展起来的,该技术可以通过增加不同范围波长的荧光基团来实现多种靶基因序列的定量分析。但因可使用的标记的荧光基团的激发波长带宽与检测波长带宽范围的限制,目前最多可同时检测的靶基因序列不多,无法实现真正意义上的高通量检测。针对这一现状,本实验研究小组在基因芯片的基础上发展了TaqMan微阵列芯片检测技术[2],该技术不受检测波长等的限制,初步实现了基因的多位点定量分析。本论文以该芯片定量分析技术为基础,进一步发展建立了基于通用荧光探针的微阵列定量PCR分析技术,为生物分子的定量分析检测平台的建立打下了基础。 本论文的主要研究内容有： 1. 通用荧光探针体系的建立。通过多重在片PCR体系中特异引物和通用荧光探针(引物)比例及浓度的优化,发展建立了单荧光基团标记通用探针的多重在片PCR扩增体系。该通用探针定量体系大大降低了实验成本,拓宽了该定量技术的应用范围。 2. 荧光衰减与初始模板量数学关系的建立。在荧光定量分析中,初始靶标的浓度往往与荧光强度呈正相关。本实验研究中采用了基于能量传递的单荧光基团标记技术,根据PCR动力学原理,推导出荧光衰减率(荧光信号减弱的绝对值与芯片背景值的比率)与初始模板最存在线性关系,利用标准样品进行的多重在PCR扩增亦获得一致结果,故荧光强度的衰减也可用于定量分析。 3. 全封闭的通用定量检测体系的建立。通过对包含有五对标准模板的多样本多引物在片PCR体系的扩增优化,采用内标法进行PCR定量分析,绘制出定量标准曲线。实验让实,该方案避免了现有定量PCR外标法管间的差异,减小实验误差,提高实验检测的可靠性。通过实验研究,本研究进一步让实了基因芯片定量PCR分析方法的可行性,并确立了在该技术中的通用探针和定量方案；通过标准曲线的绘制,得到了一组可进行高通量检测的标准芯片多重定量PCR体系。该体系具有低成本、高通量、应用广泛等特点,为生物医学领域定量分析的研究应用提供了新方法。