背景和目的:血小板为含颗粒无核盘状细胞,凝血酶等激动剂能够诱发血小板表面整合素受体GPαⅡbβ3变构活化(“inside-out”信号),使其对配体(主要是纤维蛋白原,Fg)亲和力显著增高,由此导致血小板在固化Fg表面的铺展以及悬浮血小板的聚集,驱动这种铺展和聚集的动力是Actin细胞骨架重构。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在凝血酶诱导的GPαⅡbβ3变构活化过程中发挥重要作用,但其在活化GPαⅡbβ3诱发的Actin细胞骨架重构(“outside-in”信号)过程中的作用尚不清楚。mDia1(mammalian diaphanous)是黑腹果蝇翅膀中diaphanous蛋白的同源物,属于Formin相关蛋白家族。其作为细胞骨架调控蛋白,主要参与调控细胞分裂、极化、运动、张力丝的形成及神经突的生长等细胞骨架重构过程。mDia1作为小分子GTP酶RhoA的下游分子,通过与Actin结合蛋白profilin的相互作用参与调控Actin细胞骨架的重构。mDia1是有核细胞中Actin细胞骨架重构的主要调控蛋白,但其在血小板Actin细胞骨架调控中的作用尚不清楚。本课题通过分析mDia1在人源性血小板中的表达及亚细胞定位,以研究该蛋白在血小板铺展和聚集等Actin细胞骨架重构过程中的作用及PI3K对该调控过程的影响。方法:①免疫荧光法检测mDia1及F-actin在血小板中的表达及分布;②采用血小板聚集仪检测Wortmannin和抗mDia1抗体导入对血小板聚集率的影响;③Western blot检测mDia1在血小板静止、铺展及聚集过程中的表达及其与Actin细胞骨架的关系;④GST pull-down实验检测不同状态血小板内小分子GTP酶RhoA、Rac1和Cdc42活性变化;⑤免疫共沉淀法检测不同状态血小板内RhoA、Rac1和Cdc42与mDia1相互结合情况。结果:①mDia1在静止、凝血酶诱导的铺展或聚集血小板内表达总量没有明显差异;②在血小板不同铺展程度下,mDia1与F-actin均呈共定位状态;③凝血酶诱导的血小板聚集过程中,mDia1从Triton-X100可溶性胞浆部分向Triton-X100不可溶性细胞骨架部分转位;④抗mDia1抗体导入血小板后能够抑制凝血酶诱导的血小板铺展和聚集;⑤PI3K抑制剂Wortmannin能够抑制血小板聚集,抑制mDia1从Triton-X100可溶性部分向Triton-X100不可溶性部分的转位;⑥Wortmannin可抑制凝血酶诱导的血小板铺展,表现为张力丝和片状伪足形成及mDia1和F-actin共定位受阻;⑦凝血酶能够诱导铺展或聚集血小板中RhoA活性上调,且活化态血小板中RhoA-GTP与mDia1相结合的量显著增高,但是Wortmannin能够阻断由凝血酶引起的活化态血小板中RhoA活性上调,并阻断凝血酶引起的RhoA-GTP与mDia1的结合。⑧凝血酶虽能上调聚集血小板中Rac1和Cdc42的生物活性,但并未诱发其与mDia1结合,该过程也不能被Wortmannin阻断。结论:①RhoA-mDia1信号通路参与调控凝血酶诱导的血小板铺展和聚集等Actin细胞骨架重构过程;②PI3K为RhoA-mDia1信号通路的上游分子。