背景与目的干燥综合征（Sj?gren’s syndrome,SS）是一种以外分泌腺受损并累及多器官系统的全身性自身免疫性疾病,近年来,SS的发病有明显增高趋势。在中国人群中的患病率为0.33%～0.77%,仅次于类风湿性关节炎,其中90%的患者为女性,发病年龄高峰在50岁左右。SS患者最常见的症状是口干眼干,这与唾液腺和泪腺的功能损伤密切相关,但损伤的机制尚不完全清楚。在临床上,SS的患者唇腺活检的病理诊断占有重要的地位,但是,目前唇腺组织活检的病理诊断标准不能全面反映腺体的损伤程度,缺乏对病人病损程度、分期和预后的判断。需要探索切实有效,简单易行能反映腺泡分泌功能和腺泡损伤程度的病理诊断证据,能够给风湿科医生一个较明确的诊断并能预测病人的预后。因此,本研究在课题组前期研究积累的基础上,通过观察唇腺切片并尝试用显示粘液分泌的组织化学染色法——阿利新兰（Alcian Blue p H2.5）粘液染色,即AB染色,同时使用免疫组化显示细胞膜完整性的E-Cad标记染色,二者结合进行套染,即E-Cad+AB套染法,对唇腺炎症上皮损伤的状况进行观察分析。接着应用人工智能计算机AI技术和数字全切片扫描图像分析的方法对套染后的唇腺病变组织进行粘液分泌面积的定量分析。细胞焦亡（Pyroptosis）是一种新型的细胞死亡方式。也是一种炎症性的细胞程序性死亡。主要依赖于Gasdermin蛋白家族成员形成质膜孔隙造成细胞焦亡。通常由炎症性caspase-1的活化而完成。细胞焦亡与固有免疫反应密切相关,在多种病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns,DAMPs）的刺激下,巨噬细胞、树突状细胞等髓系细胞及其他组织细胞均可发生细胞焦亡,从而进一步引发炎症反应。在我们唇腺常规临床病理观察中发现:SS病人的唇腺腺泡粘液上皮有萎缩、减少和消失现象,我们推测消失的细胞有可能是通过细胞焦亡而减少,因此本研究选择了三种焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1及GSDMD,通过免疫组化方法原位检测它们在SS患者唇腺组织中的表达状况,并结合临床资料和自身抗体等指标进行相关分析,旨在探寻腺体粘液分泌减少是否存在细胞焦亡的机制。材料与方法1、样本:选取2013年至2021年间汕头大学医学院病理外检室诊断的100例唇腺活检样本。全部样本均为血清自身抗体抗SSA或SSA/Ro阳性,临床考虑干燥综合征的患者。另外收集10例来自尸检、口腔外伤和外渗性粘液囊肿切缘的正常唇腺组织作为对照。2、H＆E染色:光学显微镜下观察100例人唇腺病变的形态学改变,按照现行2016年ACR-EULAR原发性干燥综合征分类标准,对样本进行病理类型的划分,并以每4mm~2内大于一个淋巴细胞浸润灶为SS病理阳性进行诊断,将其分为FS≥1组（60例,主要包括FLS和FSLS）和FS＜1组（40例,主要包括NSCS和SCS）。3、E-Cad+AB套染:先进行E-cadherin免疫组化染色,标记唇腺腺泡上皮细胞膜,再阿利新兰（AB）粘液染色对唇腺腺泡上皮内的粘液进行组织化学染色,观察上皮粘液分泌情况并以E-cad+AB套腺上皮细胞膜阳性线性结构破损程度评价粘液的溢出情况观察。4、AI图像分析:使用3D HISTECH扫描仪对100张套染切片进行40倍扫描,导出数字切片分组存档,通过ASAP软件标注组织有效计量区域,生成结果保存为XML文件,并使用Multiresolution image interface分析ASAP的标注文件。用Openslide读取切片文件并生成组织掩码。最后使用Opencv的in Range方法进行图像处理,最终计算出每张切片粘液分泌面积占整个唇腺分泌腺泡组织面积的百分比。5、免疫组织化学染色:用Envision两步法,选择NLRP3、Caspase-1及GSDMD三种焦亡相关蛋白抗体对唇腺组织进行免疫组化染色。使用计算机Quanta Center图像分析系统对焦亡相关蛋白在炎症损伤的唇腺粘液上皮中的表达情况进行评分分析。6、统计学分析:使用SPSS（statistic25.0）进行数据分析,采用t检验、单因素方差分析、非参数秩和检验、Pearson相关分析。研究结果1、E-Cad+AB粘液套染法观察腺泡上皮损伤情况:E-Cad+AB套染可以清晰显示唇腺粘液上皮细胞轮廓界限以及粘液存在部位。E-Cad免疫组化着色于粘液腺上皮细胞膜,使其染成线型棕褐色;AB（PH2.5）粘液组织化学染色将唇腺上皮细胞分泌的粘液染成鲜艳的亮蓝色。（1）正常粘液腺体中E-Cad染色显示细胞膜为连续完整、均匀锐利的线性结构,AB粘液染色则使粘液腺上皮胞浆呈较均一的亮蓝色,腺泡内可见细小的蓝色分泌小泡。（2）炎症损伤唇腺的E-Cad+AB套染:蓝色的粘液显示腺上皮细胞先出现轻度肿胀,腔内分泌泡胀大成小空泡,进一步形成不规则的大空泡;随后腺上皮胞膜出现从细胞膜腔面到侧面和底面的部分或完全断裂,粘液融合为腔内粘液湖,若粘液腺上皮胞膜基底部破裂,粘液溢出形成腔外粘液湖;损伤后期阶段,出现腺上皮细胞萎缩、数目减少甚至消失,粘液分泌缺失。E-Cad阳性的棕褐色标记显示的细胞膜线性结构由于细胞肿胀时受压变细、变形,再出现膜线性结构粗糙、分层、中断,残缺甚至消失埋没在粘液湖中的渐进损伤变化。2、AI自动化分析粘液量（%）结果:（1）经AI自动化分析得出整体唇腺切面样本粘液量（%）的值,统计分析得出FS＜1组的粘液量（%）显著高于FS≥1组（P＜0.01）,即无灶性淋巴细胞浸润的唇腺的粘液分泌量高于有灶性淋巴细胞浸润的唇腺,提示无灶性淋巴细胞浸润的唇腺可能处于炎症损伤的早期阶段,因此,其粘液分泌量尚能维持在较高水平;提示灶性细胞聚集前上皮可能时以体液免疫损伤为主。（2）结合临床血清学资料统计发现,粘液量（%）与抗SSB抗体滴度之间呈负相关趋势（r=-0.216,P=0.035）,即抗SSB抗体滴度越高,唇腺分泌的粘液量（%）也越少,提示了越高的抗SSB抗体滴度可能使唇腺损伤更严重,其粘液分泌量越低。3、E-Cad+AB套染法观察腺体损伤评分:（1）并E-Cad+AB套染后的唇腺腺体损伤形态进行评分,腺上皮细胞水肿得1分,大小空泡形成得2分,胞膜破裂形成腔内外粘液湖得3分,腺上皮萎缩减少、分泌缺失得4分,详见正文2.2.3部分描述。（2）按损伤评分的分值将唇腺分为“[1-2)分,[2-3)分,[3-4)分及4分”四组,[1-2)组:主要为水肿和少量腔内大小空泡形成的损伤,[2-3)组:主要为腔内大小空泡和少量粘液湖形成的损伤,[3-4)组:主要为粘液腺上皮胞膜破裂性的损伤为主,可伴少量腺泡萎缩减少、分泌缺失的损伤,其中,腔内粘液湖的形成提示了粘液腺上皮细胞腔面和侧面的胞膜破裂,而腔外粘液湖代表了粘液腺上皮细胞基底面的胞膜破裂情况;损伤评分4分代表了腺体几乎完全毁损,粘液分泌缺失。由此可见,损伤评分越高代表了其对应的粘液腺体损伤程度就越高。（3）经统计发现,损伤评分[3-4)组的粘液量显著低于损伤评分[2-3)组的粘液量（P＜0.05）,提示以粘液湖形成为主的损伤已属于较严重的损伤阶段,即腺上皮胞膜破裂损伤为主的唇腺其粘液分泌功能已显著降低;损伤评分为4分的唇腺粘液量显著低于其他三组（P＜0.05）,提示该组唇腺损伤严重粘液腺上皮萎缩、减少,分泌缺失并最终毁损。（4）结合临床资料统计发现,损伤程度评分与血清抗SSA抗体滴度存在显著正相关关系（P＜0.05,r=0.204）,即抗SSA抗体滴度越高,其对应病例的唇腺损伤评分程度越高,提示抗SSA抗体也参与到腺上皮细胞膜破裂性损伤及最终分泌缺失的损伤机制中。4、细胞焦亡相关蛋白表达分析结果:（1）NLRP3、Caspase-1和GSDMD三种蛋白定位于上皮细胞的胞质中,正常唇腺组织的粘液腺上皮胞浆中未见NLRP3蛋白阳性表达,而Caspase-1和GSDMD可见粘液腺上皮胞质内有少许散在颗粒状阳性基础表达。（2）在100例炎症损伤的唇腺样本中,NLRP3、Caspase-1和GSDMD三种蛋白均呈阳性表达,且在以腺体萎缩、分泌缺失的腺上皮细胞中阳性表达最强,经统计分析后发现,NLRP3、Caspase-1及GSDMD三种蛋白的表达评分两两之间呈显著的正相关关系,这提示NLRP3炎症小体-Caspase-1-GSDMD的经典焦亡通路可能参与到SS腺泡上皮炎性损伤后上皮细胞丢失的过程。（3）经统计分析,损伤评分＞2分组中的NLRP3、Caspase-1的免疫组化表达评分显著高于损伤评分≤2分组（P＜0.01）,提示了在以腺上皮破裂、腺体萎缩及分泌缺失损伤为主的唇腺中的NLRP3、Caspase-1的阳性产物显著高于以水肿、腔内大小空泡形成损伤为主的唇腺中的表达。（4）100例炎症损伤的唇腺样本中,NLRP3、Caspase-1和GSDMD三种蛋白表达情况与损伤程度评分之间均存在显著的正相关关系,相关系数分别为r=0.327（P＜0.01）,r=0.288（P＜0.01）和r=0.243（P＜0.05）,提示无论唇腺中是否存在淋巴细胞浸润灶,损伤程度越高的唇腺组织细胞焦亡相关蛋白的阳性表达越高。结论1、首次应用E-Cad+AB套染的方法评价唇腺上皮损伤和粘液溢出的情况,该套染方法可用于唇腺上皮的炎症损伤的评价。2、AI自动化检测粘液分泌量有助于全面且准确地评价腺体分泌粘液程度。3、细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1及GSDMD在分泌物减少和无分泌的腺泡上皮中表达均显著增高,提示干燥综合征唇腺损伤的发生、发展过程中,存在细胞焦亡机制。