论文部分内容阅读
骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种高度普遍的疾病,其特征是低骨密度（Bone Mineral Density,BMD）和增加骨折的风险,称为骨质疏松性骨折（Osteoporotic fracture,OF）。值得注意的是,BMD、OP和OF是高度遗传的。BMD是被广泛用来诊断OP的金标准,外周血单核细胞（Peripheral Blood Monocytes,PBM）能够分化成破骨细胞并在骨表面附着吸收骨。目前很多研究采用差异表达的蛋白质组学技术进行OP相关研究,且识别出很多生物学相关蛋白。因此,本研究计划从中国老年人PBM中鉴定与OP相关蛋白并运用不同的方法进行验证,本研究着眼于OP的两个表型:BMD降低和OF。根据实验设计,本项研究分为四个部分:第一部分,我们采用液相色谱和质谱（Liquid chromatography and mass spectrometry,LC-MS）技术和无标记定量（Label-free quantification intensity,LFQ）方法,分别鉴定了 中国老年女性、男性 PBM样本的低BMD组vs.高BMD组（L/H）中差异表达的蛋白,这些蛋白对中国老年人的OP具有重要意义。第二部分,采用Label-free定量蛋白质组学的方法,分别鉴定了中国老年女性、男性PBM样本的OF组vs.NF组（OF/NF）中差异表达的蛋白,筛选出在两种性别样本中调控方向一致的重叠蛋白,并使用酶联免疫吸附试验方法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）探索已在两种性别样本中交互验证的分泌蛋白在血浆样本中的表达情况及其应用于转化医学的潜力。第三部分,运用体外的细胞实验,观察在不同浓度梯度的目标蛋白的刺激下,对成骨细胞和破骨细胞的生长、分化等产生何种影响。第四部分,采用孟德尔随机化（Mendelian randomization,MR）方法对第一部分和第二部分筛选出的差异表达的蛋白进行因果验证,探索血浆蛋白质和骨折之间的关联,筛选与骨折具有因果关系的蛋白质。研究目的:1.探讨中国老年女性和男性PBM样本中,不同性别的低BMD组vs.高BMD组（L/H）之间的差异表达蛋白2.探讨中国老年女性PBM样本和男性PBM样本的OF组vs.NF组（OF/NF）中差异表达的蛋白,识别OP的相关蛋白,并筛选出不同性别相互验证的易感蛋白,丰富OP相关蛋白数据库。3.采用不同的方法对筛选出来的OP相关蛋白进行验证,探索OP的相关蛋白生物学功能,为揭示OP的致病机理提供线索。4.探究与骨折相关的血浆蛋白,进一步阐明血浆蛋白与OP之间的因果关系。加深对OP发病机理的认识,有助于加强对高危人群的早期筛查。研究方法:本研究招募了 27个髋部OF的病人和24个非骨折的健康人（NF）,24个NF包括12个极端高骨密度的志愿者（即高BMD组）和12个匹配年龄与性别的极端低骨密度的志愿者（即低BMD组）构成的女性PBM样本。同时,招募了 18个髋部OF的病人和18个NF的健康人,其中18个NF包括9个极端高骨密度的志愿者（即高BMD组）和9个匹配年龄与性别的极端低骨密度的志愿者（即低BMD组）构成的男性PBM样本。首先,将PBM从外周血血浆中分离,通过Label-free（Easy-nLC 1000 and Q-exactive,Thermo）的蛋白质组学方法获得全蛋白质组学的蛋白表达谱。使用Maxquant和Perseus软件处理蛋白质组学的数据,得到蛋白质组学的定量数据,按照P＜0.05的标准分别从低BMD、高BMD组间（L/H）和骨折、非骨折组间（OF/NF）筛选鉴定出蛋白并定义为差异表达蛋白（Differentially expressed proteins,DEPs）,并采用生物信息学分析对DEPs进行功能注释。通过ELISA实验来观察血浆样本中目标蛋白在各亚组间的表达差异,对于在第二部分筛选出来的OP相关蛋白CHMP2A和ANXA1,分别检测20例OF病人和60例NF样本的表达情况,其中NF样本包括一半极端低BMD和一半极端高BMD样本的表达情况,且分别在男性血浆样本和女性血浆样本中进行检测。运用t检验分析目标蛋白在L/H组和OF/NF组之间的血浆含量差异表达情况。使用成骨细胞系MC3T3-E1和小鼠巨噬细胞系RAW264.7探索不同浓度梯度的重组蛋白CHMP2A对细胞生长、迁移和分化的影响。将重组蛋白CHMP2A加入到MC3T3-E1和RAW264.7的培养基中,形成不同浓度梯度的CHMP2A蛋白。采用qRT-PCR技术对成骨相关基因的mRNA表达情况进行检测,使用RTCA S16仪器对MC3T3-E1的生长情况进行实时监测,使用碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP）细胞染色观察MC3T3-E1细胞分化情况,用于检测CHMP2A蛋白对MC3T3-E1细胞的影响。为了研究目的蛋白对破骨细胞的影响,使用qRT-PCR对破骨细胞相关基因的mRNA表达情况进行检测,并使用Transwell测定目的蛋白对RAW264.7细胞的迁移能力的影响。通过已经公开发表的全基因组关联研究（Genome Wide Association Study,GWAS）数据库获取血浆蛋白的蛋白数量性状位点（Protein quantitative trait loci,pQTL）数据和骨折的GWAS数据,并对数据进行初步整理。本研究应用差异表达分析和孟德尔随机化的方法进行分析,来检测与OP/OF相关的潜在致病基因。研究结果:从女性PBM样本和男性PBM样本的低BMD和高BMD受试者中,分别鉴定出131个DEPs和200个DEPs。有趣的是,有三个DEPs（WNK1、SHTN1和DPM1）在女性和男性L/H中均显著且调控方向一致。GO分析显示,这些DEPs在细胞外泌体、蛋白结合和细胞-细胞粘附连接中显著富集（P＜0.05）。途径富集结果显示,这些DEPs在蛋白泛素化、ER吞噬体途径和抗原处理中显著富集（P＜0.05）。在构建蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction,PPI）网络中,有很多关键节点蛋白,包括HSPA8、PKM、AKT1和ABI1。在独立组学研究的数据挖掘表明,有174个DEPs在高加索人的OP也有显著作用,包括WNK1和DPM1。在OF人群和NF人群（OF/NF）的外PBM中进行DEPs的筛选,在女性PBM样本中鉴定出964个DEPs,其中包括792个显著差异表达蛋白和172个有无差异蛋白;在男性PBM样本中鉴定出296个DEPs,其中包括281个显著差异表达蛋白和15个有无差异蛋白。筛选出在女性样本和男性样本中发现的重叠蛋白,鉴定出83个在女性和男性样本中均显著差异表达且调控方向一致的蛋白。运用ELISA实验观察分泌蛋白CHMP2A和ANXA1在OF人群和NF人群的血浆样本中表达情况,实验结果发现CHMP2A和ANXA1蛋白在血浆样本的OF/NF组间的表达没有显著差异,与PBM样本中的结果不一致。在体外细胞实验中,通过RTCA S16仪器实时监测不同浓度梯度的重组蛋白CHMP2A对MC3T3-E1细胞生长情况的影响。加入CHMP2A蛋白的各浓度梯度一定程度上抑制MC3T3-E1细胞的生长,尤其重组蛋白CHMP2A浓度在2-8ng/ml范围内差异显著。使用qRT-PCR技术检测不同浓度梯度的重组蛋白CHMP2A对MC3T3-E1细胞成骨相关基因表达水平的影响,CHMP2A蛋白一定程度上可以抑制RUNX2、OPN、OCN和ALP基因的表达,尤其在0.5ng/ml-5ng/ml CHMP2A蛋白这个范围内,抑制作用有显著性差异。使用ALP染色技术检测不同浓度梯度的重组蛋白CHMP2A对MC3T3-E1细胞分化的影响。结果显示,在不同浓度下的CHMP2A蛋白对MC3T3-E1细胞分化没有显著差异。使用Transwell模拟跨内皮迁移,结果表明重组蛋白CHMP2A对RAW264.7细胞跨内皮迁移没有显著影响。通过实时荧光定量PCR实验观察不同浓度的重组蛋白CHMP2A对破骨功能相关基因TRAP、ITGAV、CTSK和MMP9表达水平的影响,上述四种破骨功能相关基因的mRNA表达水平差异不具有显著意义。经过工具变量（Instrumental Variables,Ⅳs）的挑选与验证,在排除了混杂因素的情况下,本研究利用孟德尔随机化多效性残差和离群值分析（Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier,MR-PRESSO）的分析方法证明了血浆蛋白SERPINA1与骨折之间存在因果关联,研究的结果显示血浆SERPINA1蛋白水平与骨折（P=0.0181）呈正相关,为进一步阐明SERPINA1影响骨折的具体作用机制提供了科学依据。但是,我们应用MR-PRESSO方法在MR分析中没有观察到其他蛋白和骨折之间的显著因果关系。研究结论:这项研究在中国老年人中确定了对OP/OF有显著影响的已知的和新的蛋白,为进一步研究OP的发病机制提供了线索。同时,CHMP2A蛋白在一定程度影响成骨基因的表达、生长情况,但对破骨细胞没有显著的影响,该蛋白质的骨生物学功能尚待深入研究。在两样本孟德尔随机化中分析了血浆蛋白与骨折之间存在因果关系,研究结果表明血浆SERPINA1蛋白水平的升高容易导致骨折的发生,其关联机制有待深入研究。