研究背景和目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球排名第五位的常见实体性肿瘤,且是癌症相关死亡的第四位病因。我国是乙型肝炎高发地区,国内HCC发病率远高于世界平均水平,占全球每年新发病例的55%,是我国第二位的“肿瘤杀手”,因而积极探索进一步提高HCC疗效的有效策略迫在眉睫。肝细胞癌的治疗手段有多种,而肝切除术仍是目前最常用治疗措施。但已行肝切除的病人术后2年复发率为50～60%,5年复发率高达75～100%,总体生存率仅26～50%。如何有效降低HCC术后复发死亡率成为肝脏外科领域亟待解决关键问题。研究表明肝癌切除术后复发与诸多因素相关,新近发现“外科应激”可能在肿瘤切除术后复发中发挥重要作用。第一肝门入肝血流阻断(Pringle Manoeuvre,PM)导致的肝脏缺血再灌流损伤(Ischemia-reperfusion,I/R)被认为是肝切除术中主要的外科应激因素。实验研究发现,继发于肝血流阻断的I/R损伤可促进结肠癌细胞的肝脏转移,也可促进肝癌细胞的血行播散和转移。在因结肠癌肝转移行肝切除的病人中,同样发现肝脏I/R损伤可以促进术后复发;HCC肝移植受者的移植术后复发与供肝I/R损伤有关,提示肝脏I/R损伤可能是促进肝癌复发转移的一个重要因素。而在HCC治愈性肝切除术中PM是否影响肿瘤复发和患者生存尚不清楚。肿瘤细胞上皮间样转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤发生和侵袭转移的一个重要机制,其分子标志物E-Cadherin及Vimentin与肿瘤细胞生物学行为密切相关,相应表达水平的改变可能会促进肿瘤侵袭运动,进而成为早期肿瘤复发的根源。此外作为黏附分子,E-Cadherin在肿瘤细胞的定植等环节亦可能发挥重要影响。由于存在不同程度的慢性缺氧,较多实体恶性肿瘤均发现有低氧诱导因子(HIFs)的异常表达。目前认为HIFs能够介导多种信号通路,并与肿瘤细胞EMT和肿瘤患者预后关系密切。目前临床应用的PM无疑将导致一过性的缺氧复氧性损伤,除对肝细胞及肝癌细胞造成病理性损伤外,其能否启动HIFs的表达以及对肿瘤细胞侵袭及定植能力会产生何种影响,值得进一步研究。针对上述研究现状,本研究提出HCC术后较高的肿瘤复发率和较低的远期生存率应部分归因于PM所致的肝脏I/R损伤。这种一过性肝脏及肝癌细胞的过氧化损伤,除表现为病理性损伤外,还可能会通过HIF1α启动细胞内系列信号通路,使得肝癌细胞表面相关分子发生改变,从而更有利于肿瘤细胞的原位或异位的粘附和种植,为肿瘤复发创造有利条件。本研究拟通过系列临床研究和基础实验以验证上述假说,并为临床HCC肝切除术中血管阻断方式的合理选择提供参考依据。材料与方法一、双向性队列研究:确定西南医院全军肝胆外科研究所为研究现场。研究人群为2000.12.1至2008.7.31期间获得治愈性切除的HCC病人。制定治愈性切除标准、合格入组标准和排除标准,建立合格研究队列。以PM为主要研究因素,选择内对照的形式,按照术中有无联合应用PM将总队列分为暴露组(Pringle)和非暴露组(Non-Pringle),进行前瞻性随访。主要研究结局为术后肿瘤复发和患者死亡。次要研究结局包括⑴术中出血量/输血量;⑵术后7天肝功酶谱;⑶住院日。根据研究内容,制定并输入合格病例调查表,通过统一随访程序获得结局资料。研究开始时间为2008.8.1,研究终止时间为2009.7.31。二、基于队列的病例对照研究:基于已建立队列,以首次切除术后1年内复发和死亡的病例与未复发、死亡的病人1:1配比,并采用“性别、年龄、HBsAg”为匹配因素,组成病例组和对照组,开展巢式病例对照研究。从初始队列中随机抽取400例病人组成对照组,分别以5年内复发(303例)和死亡病人(234例)构建病例组,开展病例队列研究。三、选定142例肝癌组织及8例正常肝脏组织标本构建300位点的组织芯片,通过免疫组织化学方法,检测了HIF1α、SNAI1、TWIST、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达,以期探讨其内在关联及与患者预后的相关性。四、利用50μM H2O2模拟缺氧建立细胞短时缺氧复氧损伤模型,并建立肝癌细胞与肝细胞的混合培养体系,采用光镜观察RT-PCR、Western blotting、激光共聚焦等技术,检测短时间缺氧对肝癌细胞和混合培养细胞上述指标的改变;进而采用裸鼠肝脏转移和皮下种植模型初步观察短时缺氧复氧性损伤对肝癌细胞转移和成瘤能力的影响。五、利用分子克隆技术,构建HIF1α过表达腺病毒。进而分别应用HIF1α过表达腺病毒与HIF1α干扰腺病毒转染HepG2细胞,之后进行短暂缺氧,检测相关分子指标的mRNA及蛋白水平改变,以探讨HIF1α在短时缺氧复氧导致的肝癌细胞上述生物行为改变中的关键调控作用。六、多中心前瞻性RCT方案的提出与实施:以能够获得治愈性切除的HCC患者为研究对象,合格病例来自国内五家大型肝胆外科中心。采用参研中心分层,中心内部置换区组随机化方案将患者分为Pringle组和non-Pringle组,实施治愈性肝切除。以HCC术后复发为主要研究结局,采用统一随访方案开展前瞻性RCT研究。研究结果1.建立了469例HCC病人队列,通过双向性队列研究发现,首次治愈切除术后复发时间平均为864.37±54.21天,中位复发时间为447.00天,1、3、5年的累积无瘤生存率为54.0%、29.0%和19.1%;总体生存期平均为1275.48±63.46天,中位生存期849.00天。1、3、5年累积总生存率为74.5%、44.9%和31.2%。2.按照术中是否行肝门阻断分为Pringle和Non-Pringle两个子队列,结果显示Pringle和Non-Pringle组中位复发时间分别为294.00d和624.00天,1、3、5年累积无瘤生存率为47.6%、26.0%,15.1%和61.7%、32.7%和26.8%,组间有明显差异(P=0.001),提示肝门阻断可能对肿瘤复发具有显著影响。Pringle组中位生存期为701.00天,1、3、5年累积生存率为69.9%、39.2%和26.1%;而Non-Pringle组为1168.00天;1、3、5年累积生存率相应为80.2%、51.3%和38.0%,提示有无肝门阻断可能对患者术后生存影响显著(P=0.002)。3.对于Pringle和Non-Pringle两组间存在的重要差异因素进行分层分析,结果表明Pringle Manoeuvre在直径≤5cm、HBV-DNA <103、有肝硬化、无门静脉高压、侵占肝段<3、Edmondson分级Ⅰ+Ⅱ、规则性切除、TNM分期T1和无输血水等水平上对于HCC患者预后可能具有显著影响。4. RR值和AR值的分析结果表明,无肝门阻断条件下行治愈性肝切除可能会降低术后1年HCC复发风险(RR,0.7536;AR,11.81%),而对3、5年的肿瘤复发无显著影响;同时可能会降低术后1年(RR, 0.6646;AR, 17.18%)、5年(RR,0.6402)病人死亡风险。5.通过单因素和多因素回归分析,结果显示Edmondson分级、TNM分期、肝门阻断、术中出血4个因素为HCC治愈性切除术后复发的危险因素,会增加肝癌复发的几率。而肝门阻断、肿瘤边界、侵占肝段数目、Edmondson分级、TNM分期、术中输血为术后生存的危险因素,会增加肝癌术后死亡几率。6.影响因素间交互作用分析显示,PM与肿瘤侵占肝段数、边界、Edmondson分级、结节数和术中出血有交互影响,同时出现可能会对术后复发和死亡起到进一步促进作用。7. PM可能是HCC术后1年复发、死亡和5年死亡的独立危险因素。术后1年复发的危险因素还包括肝脏血管癌栓、术前AFP、Edmondson病理分级、TNM分期、结节数目及肿瘤直径;术后1年死亡的危险因素还包括肝脏血管癌栓、边界、肝硬化程度、Edmondson病理分级、TNM分期、直径;术后5年死亡的危险因素还有肿瘤侵占肝段数目和Edmondson分级。术后5年复发的危险因素为肝脏血管癌栓和Edmondson分级;而PM不是5年复发的危险因素。8.通过300个位点的组织芯片检测分析,证实完全上皮表型HCC仅占较少比例,混合表型及间质表型HCC占更大比重,EMT在HCC中普遍存在且与较差的预后相关联。HIF1α在HCC呈现较高阳性表达率,TWIST和SNAIL1在肝癌组织中的表达相互关联,且两者与EMT分子标志物相关。9.应用50μM的H2O2建立肝癌细胞短时缺氧模型,发现30 min缺氧性损伤对于肝癌及肝细胞病理形态均无显著影响,但肝癌细胞复氧后的氧化应激性损伤相关酶谱(AST、ALT、LDH)改变更为明显。30 min缺氧复氧性损伤会导致肝癌细胞HIF1α、SNAIL1、TWIST、Vimentin的增高表达和E-Cadherin的下调,同时有ROS明显生成。10.成功构建了包含HIF1α重组腺病毒表达载体,其感染效率高,能够显著增强HepG2细胞HIF1α的表达。应用Ad-HIF1α和Ad-HIF1α-siRNA腺病毒感染HepG2细胞,通过调控内源性HIF1α的表达,发现HIF1a上调,能够使短时缺氧导致的HepG2细胞表面分子改变更加显著,而抑制HIFα则显著减弱了TWIST、SNAIL1、Vimentin的表达。11.多中心前瞻性RCT研究已完善国际临床试验注册并通过医学伦理审查,目前已成功启动并顺利实施中,预期于2015年获得全部研究结果。结论1.通过双向性队列研究及病例对照研究结果提示,PM对HCC治愈性切除术后患者近期恢复无显著影响,但可能会促进肿瘤复发和死亡,以术后1年内影响更为显著,且可能是HCC治愈性切除术后1年复发、死亡和5年死亡的独立危险因素。2.通过142例肝癌的组织芯片检测结果提示EMT在HCC中普遍存在且与较差的预后相关联,而HIF1α和E-Cadherin、Vimentin在该过程中发挥了重要的作用。3. 30 min短暂缺氧能够导致肝癌细胞HIF1α、TWIST、SNAIL1及Vimentin等分子明显增高表达,肝癌细胞侵袭和成瘤能力亦显著增强,提示短时缺氧复氧过程可能会促进肿瘤的复发进程。4.通过干扰和过表达HIF1α,证明其在H2O2导致的短时缺氧复氧对肝癌细胞生物学效应中发挥关键的上游调控作用。5.本课题设计并启动了一项国内多中心前瞻性RCT研究,预期结果将为Pringle Manoeuvre对HCC术后复发的不利影响提供更加有力的循证医学证据。