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尽管辣椒病害很重的重要的蔬菜,WRKY在植物生长发育和应答环境逆境中起重要作用的植物最大转录因子之一,但WRKY录因子在辣椒抗病中的作用仍不清楚。本文研究了拟南芥AtWRKY40的同源基因Ca WRKY40b在辣椒免疫反应调节中的作用,主要结论如下:1、Ca WRKY40b的推导氨基酸序列中含有一个高度保守的含有(C-X5-C-X23-H-X1-H)锌指结构的WRKY域,与番茄、马铃薯、野生种烟草、拟南芥和水稻中的同源基因分别有87%,82%,71%,58%和45%序列同源性,与辣椒中的另一个Ca WKRY40有59.46%的氨基酸序列同源性。2、通过构建35S::CaWRKY40b-GFP融合载体,并将其转化到农杆菌GV3101菌株中,通过农杆菌注射进行瞬间表达并在激光共聚焦显微镜下观察,结果发现CaWRKY40b-GFP融合蛋白大多数定位在细胞核中,只有少部分(2/60)定位在整个细胞。而空载体的瞬间表达的辣椒叶片中,所有的GFP信号分布在整个细胞。此外,鉴于Ca WRKY40b启动子上含有W-盒及WRKY转录因子一般参与植物抗病反应,暗示该基因可能参与辣椒抗病反应。为了验证该假设,我们进一步分析了青枯菌接种的辣椒植株中Ca WRKY40b的表达,结果发现Ca WRKY40b的转录表达在青枯菌接种下显著下调。3、为了进一步分析Ca WRKY40b在辣椒应答青枯菌接种中的作用,我们采取病毒诱导基因沉默(VIGS)的方法使辣椒植株中Ca WRKY40b发生沉默,并分析基因沉默的辣椒植株对接种青枯菌的抗性,结果表明,我们所采用的两个独立Ca WRKY40b的VIGS载体均能使该基因的表达相对于对照下调,其表达量均为对照的10%左右。青枯菌接种7d后Ca WRKY40b沉默的辣椒植株表现出对接种青枯菌的抗性,而对照植株表现出很明显的枯萎症状;此外,我们还检测了在青枯菌接种24到48h的青枯菌的生长情况,结果发现,Ca WRKY40b沉默相对于对照植株显著地抑制了青枯菌的生长。所有这些结果表明,Ca WRKY40b沉默导致辣椒植株抗青枯菌接种水平提高。4、为了进一步验证上述基因沉默的结果,我们在辣椒植株上进行了Ca WRKY40b和Ca WRKY40b-SRDX(Ca WRKY40b嵌合抑制本)的瞬间超表达及其对辣椒过敏反应等影响。结果表明,Ca WRKY40b-SRDX的瞬间超表达显著激活了辣椒叶片过敏性细胞坏死和H2O2的积累,表现为很深的台盼兰染色和DAB染色以及提高的叶片离子渗漏。然而,Ca WRKY40b的瞬间超表达未能激活明显的细胞坏死。5、前期通过 ChIP-seq 分析发现基因 CA00g87690(CaWRKY40),CA05g11520(JAR1),CA06g24540(HSC701),CA01g13570(EIN3),CA02g12020(FLS2),CA10g01730(RLK1),CA05g11620(CNGIC8)and CA09g10430(cCDPK13)可能是Ca WRKY40b的靶基因。为了验证这些结果,我们进一步开展了辣椒瞬间表达Ca WRKY40b后是ChIP-qPCR分析,结果表明瞬间表达Ca WRKY40b可结合上述基因的启动子,但是,对其它CaPR1,CaNPR1和CaDEF1三个免疫反应相关基因的启动子不结合,而根据ChIP-seq分析的结果,这些基因也不是Ca WRKY40b的靶基因。6、为了进一步分析CaWRKY40b是否对上述验证的靶基因有转录调控作用,我们进一步分析了这些靶基因的转录表达受Ca WRKY40b基因沉默的影响,结果表明,CaWRKY40,JAR1,BPR1,EIN3,FLS2,RLK1,CNGIC8 或 CDPK13 等基因的转录受到青枯菌接种的诱导上调,但是在CaWRKY40b的基因沉默植株上,上述基因的转录表达无论在青枯菌接种还是没有接种的情况下均较对照有显著提高。此外,我们还分析了Ca WRKY40-SRDX瞬间表达对这些基因表达的影响,结果发现Ca WRKY40-SRDX瞬间表达相对于对照可显著提高Ca WRKY40,JAR1,BPR1,EIN3,FLS2,RLK1,CNGIC8和CDPK13的转录表达。而Ca WRKY40b的瞬间表达却显著下调这些基因的表达。7、我们还通过瞬间表达分析了Ca WRKY40b对自身的编码基因表达的调节,ChIP-qPCR分析结果表明,Ca WRKY40b可结合Ca WRKY40b的含W盒的启动子,荧光定量PCR分析结果表明,Ca WRKY40b在辣椒植株上瞬间表达可显著提高Ca WRKY40b的转录表达,且还可促进pCaWRKY40b::GUS瞬间表达中GUS基因的表达以及GUS酶活性的提高。综上所述,CaWRKY40b在辣椒应答青枯菌侵染过程中充当负调节因子,它在青枯菌侵染下表达下调,不仅可直接调节CaWRKY40,JAR1,BPR1,EIN3,FLS2,RLK1,CNGIC8或CDPK13等基因的转录表达,还可以结合自身启动子实现自身的转录调控。