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甘蓝型油菜是全球温带气候栽培的重要油料作物,而菜籽油则是油料作物中植物油的主要来源,在世界范围内排名第二。在全球范围内,作物潜在产量低的主要原因是各种性状的抗逆性和机械化程度较低,且作物的生长发育经常面临恶劣的环境条件。油菜花期交错,尤其在恶劣的环境条件下,使角果在成熟时开裂,导致产量和利润下降。因此,研究油菜角果开裂或开裂区（DZ）的机理,有助于鉴定参与该过程的关键基因。首先,我们通过观察角果发育和成熟阶段,筛选出角果抗裂和易感材料,以期找出具有高度抗性和易感性的品种。然后,我们从转录水平上分析了油菜抗裂机制,并鉴定了该机制中的关键基因。通过T-DNA插入突变体对鉴定的关键基因进行功能鉴定,以发现新的性状特异性关系。此外,我们选择聚半乳糖醛酸酶（PG）基因家族进行分析,以探讨陆生植物果实发育与角果抗裂的关系。主要的研究结果如下:1.甘蓝型油菜比较转录组学研究首先,我们通过对500多个油菜品种的表型观察和角果抗裂性观察,筛选出了抗裂和易感材料,选择两个数据集进行转录组分析:1)抗性（P22）和易感性（P124）,2)ZS11角果发育阶段（3 to 46DAP）,选择ZS11（果皮）的转录组进行分析是为了更好地了解角果开裂所参与的时空转录变化。随后,我们对P22和P124不同发育阶段的角果进行取样,通过比较转录组学研究,我们在角果六个发育阶段（授粉后14-49天,间隔7天）之间进行比较,鉴定了 7,587个差异表达基因（DEG）。在每个材料中,42-49DAP中均存在较高数量的DEGs,这表明它在开裂区形成机制中具有重要作用。然后对DEGs进行K-means聚类和WGCNA分析,以锁定候选基因。通过K-means聚类,我们获得了两个相关的集群簇,每个簇均由与开裂密切相关的衰老相关基因组成。GO富集分析表明,这些基因主要富集在衰老、老化、细胞壁分解、缺水和激素活性等方面,这与相邻阶段之间和材料之间的DEGs的GO分析相一致,表明衰老、激素和木质素沉积在角果开裂中发挥重要作用。加权相关分析（WGCNA）揭示了两个关键的共表达模块,这些模块由与开裂相关的MEyellow和MEpink组成,且49 DAP中的模块与 MEyellow（r2=0.82,p=9E-10）和 MEpink（r2=0.62,p=6E-5）显著相关。MEyellow包含的基因参与了“衰老”（GO:0010150）,“叶老化”（GO:0010150）,“气孔关闭”（GO:0090332）和“赤霉素代谢”（GO:0009685）等过程;在MEpink中则主要为“果实发育”（GO:0010154）,“木质素代谢”（GO:0009808）和“细胞壁修饰”（GO:0042545）等生物学进程。这些模块中所有相应基因的功能直接或间接参与角果裂开,表明后期发育阶段在甘蓝型油菜的角果开裂中具有关键作用。因此我们选择了 MEyellow模块中两个转录因子作为候选基因,即 Bna.A05ABI5（BnaA05g08020D,K-within=379.15）和Bna.C03ERF/AP2-3（BnaC03g09040D,K-within=422.50）,且它们具有最高的 K-within值。通过下调上游基因的转录,使转录因子Bna.C03ERF/AP2-3上调从而减少了上游SHP1/2的转录,增强了角果抗裂性。同时,另一个关键基因Bna.A05ABI5上调SAG2,ERF/AP2和一些LEA蛋白相关基因的表达,从而改变木质素细胞的机械力。在角果破裂基因中,我们发现易感材料中的Bna.C07SHP1/2和Bna.PG1/2基因上调与最小的抗性相关。此外,我们观察到抗性材料中Bna.WAG2的上调降低了细胞松弛过程中的聚半乳糖醛酸酶活性,而木质素的生物合成途径中,CCoAOMT基因可能会增加木质素的沉积来促进开裂。通过实时荧光定量PCR对12个DEGs中的BnaPG,BnaWAG2和BnaABI5进行验证,进一步证实了转录组结果的准确性。另一方面,对ZS11从3 DAP到46 DAP角果皮（SP）进行取样,以探索与角果成熟有关的上调基因。WGCNA分析显示,MEblue与SP的相关性更高（r2=-0.82,p=5E-06）。MEblue模块的GO分析标明了一些重要生物学过程,如“衰老”(GO:0010150,“叶老化”（GO:0010150）,细胞壁修饰”（GO:0042545）“细胞死亡调控”（GO:0010941）和“乙烯介导的信号通路”（GO:0009873）。基因表达分析发现ADPG1/2,NST1和其他一些衰老相关基因在40至46 DAP上调。1.1 ZS11和角果开裂特殊材料（P22和P124）的交互分析为了检测时空SP的和角果开裂（SS）的转录关系,我们整合了 MEyellow和MEblue模块,结果表明二者有671个共同基因,且具有较高的统计学意义（p=2e-105）。对671个基因的GO分析揭示了与角果开裂有关的重要生物学过程,如衰老,生殖结构发育,ABA反应,果实发育,衰老等。有趣的是,在重叠分析的“生殖结构发育”（GO:0048608）中发现了基因Bna.A07PG1,表明PG基因在角果开裂中发挥作用。这些结果表明,SP发育中的时间转录变化可能在DZ形成中起重要作用。Bna.A07PG1的进一步研究可能会为改善甘蓝型油菜角果开裂提供新的思路。最终,我们从两个转录组数据集中选择30个性状特异性基因,期望通过T-DNA突变体的研究进一步探索与角果开裂的功能相关性。2.T-DNA突变体和CRISPR Cas9系统对关键基因的功能研究从性状特异性材料（角果开裂）和ZS11的转录组分析中,我们选择了 30个候选基因通过拟南芥T-DNA插入突变体进行功能验证。经过基因分型和表达分析后,突变体（naxt1,dox1,rpk1,cpy7,wakl4,sbt3,wak1,sqp1 and asmt）被用于分析性状特异性参数,如角果抗碎指数（silique shatter resistance index,SSRI）。通过SSRI分析,两个高度易感的突变体（erd6和tmk3）和三个抗性突变体（nst1,adpg1和adpg2）被用于进一步的PG活性研究、木质素积累和木质素染色分析。前期研究结果表明,PG基因参与了 DZ中分离层的形成,因此我们选择ADPG1和ADPG2来构建多基因敲除株系,以更好地了解甘蓝型油菜中DZ的形成。基于多重敲除的目的,我们构建了三个载体,使得其中的两个能够分别靶向ADPG1（Bna.A07PG1,Bna.A09PG1,Bna.C08PG1 and Bna.CnnPG1）和 ADPG2（Bna.A04PG2,Bna.A05PG2,Bna.C04PG2-1 and Bna.C04PG2-2）,第 3个载体则同时靶向这2个基因。通过PCR鉴定了 T0代筛选的阳性转基因植株,在此基础上可进一步探索ADPG基因在甘蓝型油菜中的作用,以提供新的研究思路来改善角果开裂。3.PG基因家族的进化分析及其在果实发育中的作用PG是一种水解酶,参与果胶降解、角果开裂和果实软化。本研究中,我们从54种植物中鉴定了 2,786名PG成员,这些成员可以分为三大类。对这些植物的进化分析表明,PG家族起源于风叶藻类绿藻,而维管细胞-被子植物分化后,亚组A2-A4由亚组A1演化而来。全基因组复制（Whole-genome duplication,WGD）是导致PG基因扩增的主要原因。值得注意的是,在整个进化过程中经历了更多的WGD和全基因组三倍复制（WGT）事件的植物保留了更多的PG家族成员。例如,来自共同祖先的黄瓜（Cucumis sativus）包含61个PG成员,而由于进化史中额外的WGD事件,大豆中则具有97个PG成员。有趣的是,PG蛋白在双子叶植物中不断扩展,而在双子叶-单子叶植物分化后在单子叶植物中缩减。表达分析表明,A组中的PG基因在花器官中表达水平较高,B组和C组中的基因在生殖和营养部位的许多组织中也有高水平表达。此外,三个BnaPG15成员因其在油菜角果开裂中的可能功能而受到关注。以上研究表明,PG基因家族的扩充似乎与植物从非被子植物到被子植物的稳定发展有关。苔藓和早期维管植物中的PG成员可能起源于种子植物散布后的苔藓植物。基因表达模式则表明高等植物中PG家族蛋白功能的分化和保守性。综上所述,我们分析了两个转录组数据集,发现了与DZ形成或角果开裂相关的重要基因（ABI5,SAG2和ERF/AP2,ADPG等）。通过T-DNA突变体的研究,我们选择ADPG1和ADPG2作为候选基因,并通过CRISPR-Cas9系统构建敲除株系进行功能研究。此外,对PG基因家族的进化分析,了解了该家族在植物果实发育和坐果过程中的作用。