缺血性脑卒中是一种急性脑血管疾病,由各种原因造成局部缺血缺氧而引发的神经元损伤性疾病,常伴有严重的后遗症,发病急骤,是单病种致残率最高的疾病,近年来发病率呈逐年上升趋势,发病年龄也趋向于年轻化。其发病机制非常复杂,主要涉及脑组织能量代谢障碍、兴奋氨基酸毒性、氧化应激、炎症反应、离子稳态失衡和神经细胞凋亡等方面。近年来许多研究表明,炎症反应在脑缺血损伤过程中发挥重要作用。抑制炎症反应对于减轻脑缺血性损伤意义重大。目前,用于治疗缺血性脑损伤的抗炎药物主要包括抑制白细胞药物、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)抑制剂、抗肿瘤坏死因子(Tumornecrosis factor-α,TNF-α)药物、抗细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)药物、环氧酶 2(Cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂等,这类药物均是仅针对体内单一介质的抗炎性细胞因子单克隆抗体或受体拮抗剂。针对复杂的炎症反应机制,单靶点药物治疗往往难以达到预想的效果,并且具有一定的毒副作用。因此,开发拮抗炎症级联反应,且针对炎症网络进行整体调节的多靶点药物是基于抗炎策略治疗脑缺血损伤药物研发的新方向。根据中药复方具有多靶点、多系统作用的独到优势,基于现代药理学和组合靶标思路的临床组合用药的药物研究策略,本课题组前期构建了基于均匀设计结合权重法,运用液相蛋白芯片技术的中药组分抗炎药效筛选配伍研究方法,并通过对解表清热活血类中药桅子、川芎和葛根中的有效组分栀子苷、川芎嗪和葛根素进行的优化配伍研究,获得了能够改善脑缺血损伤作用的中药组分复方ZGC:该方具有抑制多种炎症细胞因子的表达,明显降低大鼠脑缺血/再灌注损伤脑梗死面积和神经症状评分,显著延长大鼠血浆的凝血酶原时间和凝血酶时间的作用。其良好的抗炎、抗凝血和保护脑组织作用为本论文的药物机制研究分析提供了坚实的药理基础。中药组分复方具有多种活性成分,是以多靶点多系统发挥作用。传统单一或几个靶点的研究模式往往只是解释某一方面的作用机制,很难对其作用靶点和机制有全面和系统的认识。基因芯片技术是一种通过高通量、大规模、自动化杂交的方法对大量核酸信息进行快速检测的技术。其系统、整体的思维方式,克服了常规分子生物学技术只检测某一生理病理过程中的一个或几个基因改变,而忽视不同基因间相互作用的不足,并且基因芯片的高通量、系统性、多参数平行检测特点,适合于中药复方多成分、多靶点、多途径、多系统作用的综合分析,从而对中药作用的复杂机制提供科学的解释。基于以上特点和优势,近年来基因芯片技术已逐渐应用于中药抗心脑血管疾病、抗肿瘤等药物研究领域,并取得了一定的研究成果。因此,本研究首先评价ZGC对炎症因子释放的影响,继而采用基因芯片技术重点研究ZGC对RAW264.7炎症细胞模型全基因组表达模式的影响,寻找出经ZGC作用后表达有显著差异的基因,并对这些基因进行了生物信息学分析,寻找ZGC抗炎,干预缺血性脑损伤作用的靶基因。第一部分:LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的复制目的:本实验确定复制RAW264.7细胞的炎症模型所需LPS的剂量。方法:本实验利用不同LPS浓度刺激RAW264.7细胞,通过检测细胞分泌IL-6水平变化确定LPS的剂量,复制RAW264.7炎症细胞模型。并采用CCK-8法确定此剂量作用于RAW264.7细胞的安全性。结果:LPS的0.5、1、2、4ug/ml浓度剂量均可诱导RAW264.7细胞分泌IL-6,且随着LPS刺激浓度的增加而增加。1ug/ml的LPS对RAW264.7细胞无毒性。结论:复制完成RAW264.7炎症细胞模型,确定LPS诱导剂量为1ug/ml第二部分:中药组分复方ZGC抗LPS诱导的RAW264.7细胞炎性损伤的作用研究目的:确定中药组分复方ZGC的安全剂量及抗炎作用方法:使用CCK-8法检测不同浓度的中药组分复方ZGC作用于RAW264.7细胞后,活细胞的数量变化,确定中药组分复方ZGC的安全剂量范围;利用LPS刺激RAW264.7后,建立炎症模型。在此基础上,使用中药组分复方ZGC干预后,采用ELISA技术检测给药后细胞上清IL-6的分泌情况变化,验证中药组分复方ZGC的抗炎作用。结果:CCK-8实验结果显示,中药组分复方ZGC作用于RAW264.7细胞24H后,随着药物浓度的升高,细胞的存活率降低,抑制率上升。400ug/ml及以下为安全剂量。ZGC给药组和LPS模型组相比,细胞上清的IL-6分泌量显著下降,有统计学差异,说明中药组分复方ZGC可以抑制RAW264.7炎症模型IL-6的分泌水平。结论:确定中药组分复方ZGC研究剂量为400ug/ml,明确其抗炎作用。第三部分:中药组分复方ZGC抗LPS诱导RAW264.7细胞炎性损伤的全基因表达谱研究目的:利用全基因组表达谱芯片技术,研究ZGC对RAW264.7炎症细胞模型全基因组表达模式的影响,寻找ZGC抑制炎性反应,干预缺血性脑损伤作用的靶基因,探讨其作用机制。方法:利用LPS刺激RAW264.7后,建立炎症模型;在此基础上,使用中药组分复方ZGC干预后,提取RAW264.7细胞的全RNA,利用基因芯片技术,研究不同组别之间的差异基因,探讨中药组分复方ZGC的抗炎作用机制。并用荧光定量聚合酶链式反应(QPCR)法进一步对部分差异基因表达进行验证。结果:按log2|Fold change|≥0.585且P<0.05为表达有显著性差异基因的筛选标准,分析结果显示,与正常对照组相比,模型组上调基因数136个,下调基因数25个;与模型组比较,模型给药组下调基因53个,上调基因数8个。对比正常组,有十个共同差异表达基因在模型组上调,在给药干预后下调。为进一步有针对性地分析药物干预作用基因,将差异基因筛选标准设为log2丨Fold change|≥1且P<0.05,结果显示与模型组相比较,给药组上调基因5个,下调基因24个,共29个差异基因。得到的差异基因主要涉及免疫炎症相关反应、氧化还原反应,葡萄糖能量代谢,蛋白质的酶解等生物过程及组成细胞、组织的相关结构。其中和免疫炎症相关的基因有 C4bp,Serpina3j,Mgat3,Psma6,Siglec-G,foxf-1。其中与模型组比较,给药组的C4bp基因表达显著上调,差异>1000倍,下调了Mgat3、Psma6、Siglec-G,foxf-1等基因。实时荧光定量PCR验证部分基因,结果与基因芯片的检测结果趋势一致。对差异基因进行功能的富集分析,发现LPS造模主要影响细胞的糖代谢、能量代谢、离子转运及细胞的增殖增长等代谢途径;ZGC主要通过能量代谢、免疫应答、组织形态等方面发挥作用。结论:药物发挥抗炎性损伤效应是通过一个复杂的生物网络,经多途径发挥作用。ZGC可通过影响多基因表达而发挥抗炎改善脑缺血损伤的作用。