干细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的未分化细胞，不仅存在于胚胎早期，而且在成体多个组织或器官中也有定植，是维持该组织/器官正常代谢及病理状态下修复损伤的主要细胞来源。小肠上皮组织主要由吸收细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞及潘氏细胞四种分化成熟的细胞组成。小肠上皮不断进行着自我更新，使上皮细胞的衰老死亡和增殖分化处于平衡状态，这一功能是由肠上皮干细胞(intestinal epithelial stem cell，IESC)来维持的。目前认为IESC位于小肠隐窝的基底部，距底部约4～6个细胞的位置。通过测定IESC标志基因明确其在整个小肠的分布情况及与小肠上皮增殖的关系，有助于进一步探讨IESC的生理功能，对研究干细胞在组织损伤修复和肠道肿瘤发生过程中的作用也有重要意义。 Musashi-1(Msi1)是一种进化保守的RNA结合蛋白，在维持干细胞自我更新、分化和肿瘤发生方面起着重要作用。在哺乳动物小肠中，Msi1在距隐窝基底部4～6个细胞处的细胞中表达，与公认的IESC位置相符，提示Msi1可以作为IESC的标志分子。Musashi—2(Msi2)也是Musashi家族中的成员，它和Msi1在神经前体细胞共同表达，在维持细胞干性和细胞增殖中发挥重要作用。但是，目前为止尚未见有关Msi2和Msi1在整个小肠中的分布特征的报道。 Hairy and enhancer of split1(Hes1)是一种基本螺旋－环－螺旋结构的转录因子，是Notch信号通路的下游分子之一。研究表明，Hes1和Msi1在成体及胚胎阶段的小鼠小肠中均共表达于肠隐窝底部的IESC。但是直到现在，对Hes1和Msi1阳性细胞的定位和表达水平的研究仅限于小肠中的某一段，Msi1、Msi2和Hes1在整个小肠中的表达特征、相互之间的关联，以及上皮细胞增殖与各标志基因表达的关系均未见报道。 本次研究通过在mRNA及蛋白质水平上测定Musashi家族基因(Msi1和Msi2)和Hes1在小鼠整个小肠中各段的表达，明确各基因的表达特征，并与采用BrdU和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫染色方法所获得的小肠上皮增殖指数进行对比，探讨在整个小肠的范围内IESC标志分子表达与肠上皮增殖之间的关系。 研究目的： 1.通过测定IESC的标志分子Msi1、Msi2及Hes1在各段小肠中的表达，探讨各基因在整个小肠中的表达特征； 2.探讨各标志分子的表达与小肠上皮结构特征和增殖的关系。 研究内容及实验方法： 1.实验动物及组织来源 所有实验动物来源于广州中山大学实验动物中心。取8周BALB/c小鼠6只(3雄3雌)。所有小鼠脱颈处死前2小时均给予BrdU腹腔注射，注射剂量为1ml/100g。完整取出整段小肠，去除头端的5cm，剩余小肠等分为4段，分别为命名为空肠-1、空肠—2、回肠-1及回肠—2。每段小肠用0.1M PBS(pH7.4)冲洗干净用于下一步研究。 2.组织学分析 各段小肠组织标本取中间一段约1cm，经4％多聚甲醛固定，常规脱水后石蜡包埋，连续切片，分别用于HE组织形态学和免疫组化分析。在组织学分析小肠各段形态特点中，计算绒毛—隐窝高度和隐窝密度。绒毛—隐窝高度计算方法为绒毛顶端至隐窝底部的垂直距离；隐窝密度的计算方法为计算300μm单位长度小肠中的隐窝数量。 3.实时定量PCR 总RNA用TRIzol一步提取法，通过UV—2450分光光度计计算样品260nm处紫外光吸收值来计算分离出的总RNA浓度。使用ReverTra Ace—α试剂盒将1μg的总RNA逆转录为cDNA。在Rotor—Gene6000型机器上使用Realtime PCR Master Mix试剂盒进行实时定量PCR。每次实验重复两次，取平均值以备下步分析。引物如下：小鼠Msi1，5’—TAG TTC GAG GGA CAG GCT CT—3’(上游)和5’—GTT GAG GGACAG GCA GTA GC—3’(下游)；小鼠Msi2,5’—CCG GAG TGG GGA ATT ACA TA—3’(上游)和5’—CAT AGT GAG ACG GCA ATG GA—3’(下游)；小鼠Hes1，5’—GGAGAG GCT GCC AAG GTT TT—3’(上游)and5’—GCA AAT TGG CCG TCA GGA—3(下游)；小鼠18S核醣体RNA(18SrRNA)，5’—GCT AGG AAT AAT GGA ATA GG—3’(上游)和5’—ACT TTC GTT CTT GAG GAA TG—3’(下游)。18SrRNA作为内参，使用ΔΔCt方法分析数据。 4.Western blots分析 将各段小肠标本在4℃条件下切碎至1mm3大小以下用于Western blots分析。在各组织标本中加入500μl RIPA裂解缓冲液。裂解液上清的总蛋白量用BCA蛋白浓度试剂盒测量。用12％的聚丙烯酰胺凝胶为分离胶，进行垂直电泳(SDS—PAGE)，每孔蛋白样本上样量为40μg。电泳后电转至PVDF膜，与稀释于封闭液(5％奶粉，含0.1％Tween20的TBS)的一抗孵育，抗体如下：兔抗小鼠Msi1抗体(1:500)，兔抗小鼠Hes1抗体(1:500)，兔抗小鼠β—actin抗体(1:1000)。二抗为辣根过氧化物共轭抗兔抗体(1:2000)。使用ECL化学荧光系统检测Msi1，Hes1和β—actin蛋白。通过扫描密度计量学和Glyko BandScan5.0软件分析确定蛋白条带的辉度，以β—actin作为内参分析数据。 5.免疫组织化学 Msi1的免疫组化采用SAP法，4℃孵育1:200稀释的兔抗鼠Msi1多克隆抗体一抗过夜，用NBT显色，核快红复染；Hes1及PCNA免疫组化染色方法用SP法，用0.01M枸橼酸盐缓冲液微波高温抗原修复8min，3％H2O2室温孵育10min，羊非免疫血清10min，加一抗4℃孵育过夜(兔抗鼠Hes1多克隆抗体1:200；兔抗鼠PCNA单克隆抗体1:400)，生物素化二抗37℃10min，DAB显色5min，苏木素复染。PCNA标记的增殖指数计算方法为隐窝细胞总数中的阳性细胞百分比。 BrdU染色方法与此类似，按照BrdU染色试剂盒制造商建议的步骤，生物素结合的抗BrdU抗体室温下孵育60min，余步骤同前。BrdU标记的增殖指数计算方法为每5个隐窝中阳性细胞百分比。以PBS代一抗作阴性对照。 6.统计学处理 计量资料以均数±标准差表示(Mean±SD)，计数资料以百分率表示，线性相关用Pearson相关系数来描述，均数的比较采用t检验，率的比较采用x2检验，线性相关用Pearson相关系数来描述，P<0.05为差别有统计学意义。所有资料均采用SAS8.1统计软件处理。 结论： 1.Msi1和Hes1共表达于成体小鼠小肠隐窝基底部，它们在各段小肠的表达水平是不一致的，在空肠表达较高。 2.Musashi家族中的另一成员Msi2与Msi1共表达于小鼠各段小肠。 3.Msi1和Hes1在整个小肠的表达特征与小肠上皮细胞的增殖指数一致。