猪血蛋白源抗氧化肽生物制备技术及稳定性研究

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猪血源抗氧化肽的工业化生产有利于廉价畜副产品的开发利用,提高其附加值,且食源性功能肽保障了产品的食用安全性。为了提高猪血源蛋白的酶解效率,研究了超声波辅助酶解制备猪血源抗氧化肽的工艺条件,利用生物制备技术对酶解液进行分离纯化,并对分离纯化后抗氧化肽的稳定性进行了研究,为利用猪血进行工业化生产抗氧化肽提供了理论依据,主要的研究内容及结论如下:(1)以新鲜猪血为原料,对比三种不同蛋白酶(胰蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶)酶解液的DPPH自由基清除率和水解度,选定酶解效果较好的单一酶制剂进行水解条件的进一步研究。研究结果表明:胰蛋白酶酶解液、动物复合蛋白酶酶解液、风味蛋白酶酶解液的DPPH自由基清除率分别为56.34%、45.76%、31.43%,水解度分别为为11.58%、12.67%、9.41%。选择胰蛋白酶为单一酶制剂进行水解条件的优化研究。(2)分析胰蛋白酶超声波处理前后的SDS-PAGE电泳条带,测定胰蛋白酶超声前后的酶活力和溶解度,研究了超声波处理对胰蛋白酶活力的影响。实验结果表明:超声波处理后的胰蛋白酶活力为1.34×106u/g,比对照组提高了104.9%。胰蛋白酶溶解度为4.78%,比对照组提高了2.36%。胰蛋白酶经超声波处理前后的SDS-PAGE电泳条带分布一致,超声波处理组的电泳条带颜色比对照组的电泳条带的颜色要深一些。上述结果表明超声波处理可以提高胰蛋白酶的活力和增加其溶解度,但对胰蛋白酶的分子结构没有影响。(3)以DPPH自由基清除率为指标,胰蛋白酶为单一酶制剂,对超声波辅助酶解的工艺条件进行了研究,通过单因素试验和正交优化实验,确定了猪血源抗氧化肽制备的超声波辅助条件。研究结果表明:超声频率20kHz、超声时间8min、超声功率540W、胰蛋白酶添加量0.8%、体系维持pH8.0,酶解2h的水解度为11.73%,DPPH自由基清除率为75.78%。常规酶解6h时,水解度为11.42%。由此可见,超声波辅助可以加快胰蛋白酶的水解速度。(4)将具有抗氧化能力的猪血源血红蛋白酶解液进一步的分离纯化,以DPPH自由基清除率为指标,对分子质量小于10千道尔顿的肽粉进行抗氧化性能评定。实验结果为:胰蛋白酶酶解液经过中空纤维超滤获得分子质量小于10千道尔顿的抗氧化肽,再经凝胶层析得到具有强抗氧化性的峰Ⅳ,峰Ⅳ进过反向高效液相制备型色谱获得主要的抗氧化物质A1,通过低分辨率质谱得到A1的主要分子质量是453.350,475.543,498.435。(5)比较胰蛋白酶酶解液、分子质量大于10千道尔顿,分子质量小于10千道尔顿,峰Ⅱ、峰Ⅳ各组分的DPPH自由基清除率、还原力和总抗氧化能力,综合评定各组分的抗氧化能力。通过对比分子质量小于10千道尔顿的抗氧化肽对延缓玉米油、大豆油和自制猪油的效果,探究抗氧化肽对延缓油脂氧化的作用。结果表明经过凝胶层析分离的峰Ⅳ的抗氧化性最强。7.5mg/ml,还原力1.36,总抗氧化能力(ABTS)2.45mM。分子质量小于10千道尔顿的抗氧化肽对玉米油、大豆油和自制猪油的诱导氧化时间分别延缓18.10h、3.37h和30min。(6)以DPPH自由基清除率和总抗氧化能力(ABTS)为指标,研究了pH值、温度、食盐浓度、蔗糖浓度、柠檬酸浓度和模拟胃肠消化液对分子质量小于10千道尔顿的抗氧化肽稳定性的影响。结果表明:抗氧化肽在碱性环境均表现出较好的抗氧化能力,100℃以下加热160min均能维持较好的抗氧化能力,NaCl浓度在6%以下对抗氧化能力有促进作用,柠檬酸加入量达到0.12%以上其抗氧化能力随之下降。模拟肠胃液时,DPPH自由基清除率能维持在75%以上,而总抗氧化能力(ABTS)在肠液维持在2.45mM,在胃液下降至0.44mM。
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