生防细菌菌株A液体发酵工艺及其防病促生效果的研究

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植物病害是农业生产的大敌,约80%以上的植物病害都是由病原真菌引起的。目前对于植物病害的防治主要采用化学杀菌剂,但实践证明,化学杀菌剂存在污染环境、产生抗药性等问题。克服这一问题的重要途径之一就是采用生物防治,开发生物杀菌剂。本研究拟将本实验室自己分离的、具有自主知识产权的生防细菌菌株A(菌种保藏编号为CGMCC No.1982)开发为一种高效、广谱、廉价的生物杀菌剂,为此对菌株A的液体发酵工艺及其防病促生效果进行了初步研究,结果如下。通过采用三明治法、滤纸片法、打孔法、混匀打孔等方法测定生防细菌发酵液的拮抗能力,比较了各方法的优缺点,最终确定实验中采用改进的新方法:双层打孔法测定发酵液的拮抗能力。通过对六种不同培养基筛选,确定了菌株A的最适培养基为YDC培养基:酵母膏10g,葡萄糖20g,CaCO320g,水1000mL。采用均匀试验设计和回归分析的方法确定摇瓶培养最佳条件为:培养温度为35℃,摇瓶装量为12%,接种量3%,初始pH值7.2。在优化的最佳摇瓶培养基和培养条件的基础上,对菌株A进行了分批发酵和补料分批发酵。确定了补料分批发酵的培养基及发酵工艺条件。培养基为:葡萄糖1%,酵母膏1%,CaCO31%;流加培养基为:1.5%葡萄糖和0.5%酵母膏的混合液;并确定了流加补料的时间及发酵周期。发酵液芽孢数可达到(3.41±0.151)×109cfu/mL。发酵罐培养获得的发酵液离心得湿菌体,将湿菌体与等质量的CaCO3混匀,50℃真空干燥30min至粉末状,制得菌株A干粉菌剂。干粉菌剂活芽孢含量为(2.109±0.366)×1011cfu/g。储存温度对干粉菌剂的保存影响不大,4℃、25℃和37℃下保存180d后,芽孢存活率均在60%左右,活芽孢含量均在1011cfu/g以上。将生防菌干粉菌剂应用于植病生防试验研究,发现生防菌对桃子灰霉病的防治效果好,对黄瓜也有较高的防病和促生作用。鲜桃果实提前刺伤接种生防菌菌悬液,接种灰霉病菌4d后的防效仍可达90%以上;表面喷洒生防菌菌悬液,储藏8d后自然防病效果为55.94%,并且生防菌能在桃果实表面定殖。浸种处理黄瓜种子,促芽生长率为19.42%。浸种和拌种处理黄瓜种子,株高、株重和苗成活率分别比清水处理提高了62.26%、56.61%,35.61%、37.67%,8.2%、8.85%。经拌种处理的黄瓜苗,其离体叶片对黄瓜炭疽病菌的防效达77.92%。经菌株A处理,盆栽黄瓜苗接种病菌14d后的对黄瓜炭疽病的防效较高,其中浇灌处理的黄瓜苗防效高达49.69%。菌株A经急性经口毒性实验,结果发现大鼠无死亡例发生,说明生防细菌菌株A为微毒性。
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