甘蓝型油菜(Brassicanapus)是主要的油料作物之一。过去几十年油菜产量的提高主要得益于杂种优势的利用。化学杂交剂诱导的雄性败育是杂种优势利用的重要途径。叶片施用低剂量的苯磺隆(tribenuron-methyl,TM)可特异性地诱导甘蓝型油菜雄性败育。苯磺隆是一种高效的磺酰脲类除草剂(sulfonylureaherbicide,SU),通过锚定乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase,ALS)的催化亚基CSR1抑制支链氨基酸的合成。虽然作为有效的化学杂交剂苯磺隆已被用于油菜杂交种的生产,但是苯磺隆特异性诱导雄性败育的机理还不清楚。此外,由于过去几十年除草剂广泛而大量地使用,植物进化出的靶标抗性(csr1-1D)和非靶标(代谢)抗性(Bel)两类磺酰脲类除草剂抗性机制,使得除草剂抗性已成为全球农业的重要威胁之一,然而植物对苯磺隆诱导并参与磺酰脲类除草剂的抗性机制依然不清楚。本研究以两个油菜品种(品系)及拟南芥为研究材料,通过转基因、遗传、免疫和生理生化等多种方法,揭示了苯磺隆诱导雄性败育的机制,并试图探究苯磺隆诱导的自体吞噬在磺酰脲类除草剂抗性中的作用及调控机制。苯磺隆处理油菜后后,其花药中苯磺隆的积累量远远大于叶片和茎中的积累,随后在花药中造成了更强的乙酰乳酸合成酶抑制和支链氨基酸饥饿。在油菜和拟南芥中组成型表达或花药特异性表达csrl-lD(CSR1的显性突变),具有磺酰脲类除草剂抗性能够消除苯磺隆诱导的花药特异性的乙酰乳酸合成酶抑制和雄性败育的表型,表明乙酰乳酸合成酶是苯磺隆的唯一靶标,乙酰乳酸合成酶失活是苯磺隆诱导雄性败育的主要原因。苯磺隆涂茎实验显示:将苯磺隆涂于侧枝时,只有被涂抹的侧枝是不育的,其他侧枝和主枝都是可育的;将苯磺隆涂于主枝时,只有主枝和涂抹部位以上的侧枝的不育的,其他侧枝都是可育的。这表明苯磺隆被叶片吸收后主要极性向上运输到花药。组成型表达苯磺隆代谢基因Bel的植株能够消除苯磺隆在花药中的积累及苯磺隆诱导的雄性败育。叶肉和维管特异性表达Bel导致花药只有少量苯磺隆积累,并且苯磺隆处理后植株依然可育,表明叶片喷施的苯磺隆主要通过叶肉和维管极性运输到花药。自体吞噬是一种大量降解细胞质内含物的过程,自噬体包裹大量的细胞质基质和细胞器并将其运输到液泡降解。细胞死亡过程中常伴随自体吞噬的激活,因此这种死亡方式被称为自体吞噬型细胞死亡。花药显微和蛋白免疫分析表明,苯磺隆处理或花药特异性干涉乙酰乳酸合成酶基因诱导的雄性败育的花药细胞中,自体吞噬活性被极大地提升。与对照相比,苯磺隆处理植株的小孢子和绒毡层被大液泡化伴随着细胞质被大量降解。另外,自体吞噬抑制剂3-MA处理可以部分恢复苯磺隆造成的花粉败育。这些数据表明叶片喷施的苯磺隆被极性运输到花药,通过花药特异性地抑制乙酰乳酸合成酶造成支链氨基酸饥饿,最终诱导自体吞噬型花药细胞死亡。已有研究证明GCN2路径也与磺酰脲类除草剂抗性有关,这种抗性可能由于GCN2具有广泛抑制蛋白质合成的能力。在酵母和哺乳动物中,TOR-自体吞噬和GCN2介导的氨基酸信号转导研究已取得了重大进展。本研究结果表明,拟南芥幼苗中自体吞噬与GCN2独立地参与磺酰脲类除草剂抗性和氨基酸信号传导。苯磺隆能够激活自体吞噬和GCN2路径,且这种激活作用能被外源添加的支链氨基酸逆转,表明苯磺隆诱导的支链氨基酸饥饿对苯磺隆激活自体吞噬和GCN2负责。对苯磺隆处理后不同基因型的幼苗进行遗传分析表明,与野生型幼苗相比,atg5、agt7和gcn2单突变体表现更敏感的表型,而atg5 gcn2和agt7 gcn2双突变体表现出超敏感的表型。免疫分析表明苯磺隆激活的自体吞噬和GCN2不依赖于对方的存在。TOR是氨基酸可利用性的感知和调控者。苯磺隆可导致TOR失活,而雌二醇诱导的TOR抑制诱导自体吞噬的激活,表明苯磺隆诱导的支链氨基酸饥饿可能通过TOR失活来激活自体吞噬。另外,在苯磺隆处理的Bel(而非csrl-lD)转基因株系中自体吞噬和GCN2均被激活且对苯磺隆抗性的贡献是相互独立的。总之,这些数据表明,作为一种蛋白水解以循环利用氨基酸过程,自体吞噬可能通过补充新的支链氨基酸产生非GCN2介导的磺酰脲类除草剂抗性。综上所述,本研究报道了低剂量的苯磺隆作为有效的化学杂交剂造成花药特异性的乙酰乳酸合成酶抑制和支链氨基酸饥饿,最终导致花药细胞产生自体吞噬型细胞死亡。这为苯磺隆诱导雄性败育的机理提供了新的观点,并为其在作物杂交种的应用提供了理论基础。另一方面,磺酰脲类除草剂苯磺隆可能通过抑制TOR激活自体吞噬,激活的自体吞噬降解蛋白质循环利用氨基酸得以补充新的支链氨基酸。因此,我们认为自体吞噬是一种新的磺酰脲类除草剂抗性机制。苯磺隆也可以作为一种支链氨基酸合成的特异性抑制剂用于研究氨基酸信号转导的分子机制。本研究不仅揭示了自体吞噬在磺酰脲类除草剂抗性中的调控机制,而且增进了人们对植物中氨基酸信号的理解。