研究背景与目的： HER2是相对分子量为185kDa的跨膜糖蛋白，属细胞表皮生长因子受体家族的重要成员，具有酪氨酸激酶活性，其羧基端含自身磷酸化位点，在细胞内的信号传导中发挥重要作用。目前研究发现，在HER2过度表达的乳腺癌细胞中，HER2蛋白水平是周围正常乳腺癌细胞的10～100倍，而且晚期乳腺癌中约20％～30％患者伴有HER2的过度表达，该类患者疾病发展快，预后差，对化疗及三苯氧胺抗拒，缺乏有效治疗手段。因此，以HER2作为靶点，阻断受体介导的肿瘤细胞增殖，成为治疗晚期乳腺癌的研究热点。Herceptin是HER2蛋白的人源性单克隆抗体，研究显示Herceptin单药或与阿霉素、紫杉醇、铂类等化疗药物伍用，均显示了一定的抗肿瘤活性。但是Herceptin单药治疗晚期乳腺癌，其总有效率仅为12％-24％。与化疗药物联合，虽使有效率提高，但心脏毒性也明显提高。 因此，利用Herceptin作为载体，将具有强烈细胞毒作用的其它制剂联结到Herceptin，是解决上述问题的方法之一。放射免疫治疗是借助单克隆抗体将放射性核素特异性靶向到肿瘤抗原或受体部位，借助放射性核素发出的射线，对肿瘤产生辐射生物效应，而达到治疗肿瘤的目的。其优点如下：①、目前碘标记蛋白质技术成熟，Herceptin经131I标记后，其免疫反应活性仍然很高，与肿瘤细胞结合的能力基本不受影响。因此，131I-Herceptin作为一种放射免疫靶向治疗药物，既可保留Herceptin本身所固有的抗肿瘤活性，又可发挥131I内照射产生的放射生物学效应。②、Herceptin与乳腺癌细胞表面的HER2受体结合以后，通过下调HER2受体水平，引起蛋白激酶Akt及有丝分裂活化蛋白激酶MAPK磷酸化作用降低，减少细胞受照射后修复水平的蛋白质合成，从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。即Herceptin可提高131I对肿瘤细胞的放射生物效应。 研究方法： 1.采用Iodogen法对Herceptin进行131I标记。检测131I-Herceptin在40C储存不同时间的放射化学纯度，以观察131I-Herceptin在体外的稳定性。以家兔实验法检测131I-Herceptin的热原是否符合规定。以细胞结合法检测131I-Herceptin与HER2高表达的乳腺癌细胞株BT-474的结合能力。 2.以放射免疫显像法观察131I-Herceptin在乳腺癌裸鼠模型的分布，从影像水平评估肿瘤及其它正常组织、器官对131I-Herceptin的摄取并计算肿瘤/非肿瘤比值(T/NT)。以已知活度的放射源为标准，在注射一定剂量的131I-Herceptin之后不同时间，由机器采用肿瘤部位的放射性计数，该计数与标准源的计数比较，得到各时间肿瘤部位的累积放射性活度，以观察131I-Herceptin经静脉注射后不同时间在肿瘤部位的摄取情况。肿瘤T/NT比值与其它脏器的差别、注射131I-Herceptin后不同时间肿瘤部位累积放射性活度的差别采用One-wayANOVA检验。 3.将荷瘤裸鼠设置为三组：131I-Herceptin治疗组、Herceptin治疗组与对照组，每组5只。131I-Herceptin治疗组给予131I-Herceptin，剂量为37MBq/1mg/只，Herceptin治疗组给予Herceptin，剂量为2mg/只，对照组注射0.1m10.9％的生理盐水(N.S)/只。注射后1-9天每3天测量肿瘤大小并计算肿瘤生长的抑制率。第9天处死裸鼠，剥离肿瘤，以Western-Blot法、RT-PCR法检测肿瘤组织HER2及CEA蛋白及基因表达水平的变化。HER2及CEA基因表达水平、蛋白表达水平在131I-Herceptin治疗组、Herceptin治疗组与对照组之间的差异采用One-wayANOVA检验；131I-Herceptin治疗组和Herceptin治疗组肿瘤生长的抑制率的差异采用t检验。 4.体外常规培养乳腺癌细胞株BT-474、SKBR-3及MCF-7，以500U/ml的IFN-γ诱导上述三株细胞HER2的表达，以流式细胞仪检测诱导前后乳腺癌细胞HER2表达率及表达强度。以细胞结合法检测诱导前后上述三株细胞对131I-Herceptin结合率的变化。进一步由克隆形成试验检测诱导前后细胞的增殖能力，以评估IFN-γ诱导对131I-Herceptin的抗肿瘤活性的影响。三株细胞IFN-γ诱导前后HER2表达率、表达强度及克隆形成率的比较采用t检验。 研究结果： 1.BT-474细胞HER2的表达率为98.1％。采用Iodogen法131I对Herceptin的标记率为93％。所制备的131I-Herceptin的放射化学纯度为94％，比活度约为37kBq/ug。131I-Herceptin在BT-474细胞的特异性结合率为56.9％。131I-Herceptin在40C冰箱储存48小时内，其放射化学纯度仍高达94.2％，未见明显降解(P=0.132)。但72h后降低为82.6％，降低显著(P=0.002)。热原检查提示每只家兔体温升高均未超过0.60C，3只家兔体温升高总和为1.20C，表明131I-Herceptin热原检查符合规定。 2.注射131I-Herceptin后3h-216h，各时相肿瘤影像清晰，正常组织影像比较稀疏，影像对比度高；而且随时间延长，在注射后72h肿瘤/肌肉(T/NT)比值达最高值为4.11(F=12.37，P=0.026)；在注射后216h肿瘤的摄取分数为(16.1±1.7)％ID/g，高于其它组织、器官(F=166.15，P=0.000)。注射131I-Herceptin后3h肿瘤部位的放射性活度为(157.0±9.5)uCi，24h与48h分别为(191.7±6.4)uCi和(270.3±24.8u)Ci，在72h达到最高(F=9.136，P=0.032)，为(296.4±54.3)uCi。 3.注射治疗药物后第3、6、9天测得131I-Herceptin组的抑瘤率分别为(15.0±2.5)％、(20.0±4.6)％和(42.0±6.9)％；Herceptin组的抑瘤率分别(12.7±1.6)％、(16.4±3.7)％和(23.2±3.8)％。两组之间第3天(t=1.768,P=0.115)和第6天(t=1.370，P=0.208)抑瘤率无显著性差异，但治疗后第9天131I-Herceptin组抑瘤率显著高于Herceptin组(t=5.321，P=0.001)。治疗后第9天在蛋白表达水平，131I-Herceptin组(P=0.000)和Herceptin组(P=0.041)的HER2表达均显著低于对照组，同时131I-Herceptin组HER2的表达也显著低于Herceptin组(P=0.008)；131I-Herceptin组(P=0.000)和Herceptin组(P=0.001)CEA的表达显著低于对照组，而且131I-Herceptin组CEA的表达显著低于Herceptin组(P=0.016)。在基因表达水平，HER2的基因表达在131I-Herceptin组(P=0.000)和Herceptin组(P=0.014)均比对照组显著性降低，131I-Herceptin组还低于Herceptin组(P=0.014)。CEA在实验组与对照组之间的比较也有类似的结果。 4.乳腺癌细胞株MCF-7、SKBR-3和BT-474经IFN-γ诱导后，MCF-7细胞HER2表达率升高显著(t=3.963，P=0.032)，SKBR-3(P=0.312)和BT-474(P=0.143)细胞HER2表达率升高不明显。对照组MCF-7、SKBR-3及BT-474细胞的克隆形成率分别为(49±3)％、(37±6)％及(34±5)％，实验组相应细胞的克隆形成率分别为(30±4)％(t=6.574，P=0.002)、(23±5)％(t=3.105，P=0.041)及(19±6)％(t=3.323，P=0.034)，均显著低于对照组。 初步结论： 1.采用Iodogen标记法制备的131I-Herceptin，其放射化学纯度高，热原检查符合规定。在HER2高表达的BT-474细胞特异性结合率较高。在40C冰箱放置48小时内标记物稳定，未见明显降解。 2.131I-Herceptin在荷瘤裸鼠体内分布表明，肿瘤的％ID/g、T/NT比值均较高，显示131I-Herceptin对HER2高表达的乳腺癌具有很高的靶向特性。131I-Herceptin对肿瘤部位的累积放射性活度随注射后时间延长逐渐升高，至注射后72h达到最高，以后由于物理衰变和生物廓清，其活度逐渐减少。 3.在治疗早期，无论从HER2与CEA的基因表达水平、蛋白表达水平以及肿瘤生长抑制率评估，131I-Herceptin治疗效果均优于Herceptin，说明131I-Herceptin可以更有效地抑制乳腺癌肿瘤分裂、增殖、分化、存活，控制肿瘤生长。 4.IFN-γ可以上调乳腺癌细胞株HER2的表达，增加细胞表面的抗体结合位点，提高肿瘤细胞对131I-Herceptin的结合量，从而提高131I-Herceptin的抗肿瘤活性。