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目的:探讨FAT10通过调控eEF1A1对肿瘤细胞生物学特性的影响;分析FAT10对eEF1A1泛素化降解的影响;确定FAT10和Ub与eEF1A1结合的赖氨酸位点;分析FAT10对eEF1A1的调控机制。最终明确FAT10调控eEF1A1的分子机制及对肿瘤细胞生物学行为的影响。方法:一、沉默人各种肿瘤细胞MHCC-97H、Huh7、PANC-1、MB231和SW620中FAT10的表达,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测FAT10和eEF1A1 mRNA和蛋白的表达水平。双荧光素酶报告基因检测FAT10对eEF1A1启动子的影响。荧光共振能量转移技术(FRET)确认FAT10和eEF1A1的相互作用。在沉默FAT10表达的基础上恢复eEF1A1表达,通过CCK8增殖实验检测MHCC-97H和Huh7细胞增殖能力,通过Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;通过流式细胞仪检测细胞周期的变化。二、泛素化实验和放射菌酮实验检测FAT10对eEF1A1泛素化降解的影响;构建eEF1A1不同大小的截短体质粒,通过免疫共沉淀确定FAT10和Ub与eEF1A1的结合片段;将与FAT10和Ub结合的eEF1A1片段内的赖氨酸通过定点突变技术全部突变成精氨酸,再运用免疫共沉淀确定FAT10和Ub与eEF1A1的结合位点。三、体外竞争实验、免疫共沉淀和GST pull down技术确定FAT10和Ub与eEF1A1的结合情况;GST pull down、免疫共沉淀和激光共聚焦确定FAT10和eEF1A1与Rpn10的相互作用;体外蛋白表达、体外竞争实验、免疫共沉淀和GST pull down技术确定FAT10和eEF1A1与Rpn10之间结合的相关性。结果:一、RT-PCR以及Western blot结果表明:肿瘤细胞MHCC-97H、Huh7、PANC-1、MB231和SW620中干扰FAT10的表达,可观察到eEF1A1的表达也随之下降;但干扰eEF1A1的表达,却未观察到FAT10的表达的变化。并在稳定低表达FAT10的肿瘤细胞中得到进一步的验证,干扰FAT10表达的同时过表达eEF1A1,可观察到eEF1A1的表达水平得以恢复。为分析肿瘤细胞FAT10对eEF1A1调控的机制,通过双荧光素报告基因检测发现FAT10对eEF1A1基因启动子的活性没有调控作用,而通过FRET确认FAT10和eEF1A1的存在相互作用。流式细胞周期和CCK8增殖实验分析,干扰FAT10组、干扰eEF1A1组较正常对照组,肿瘤细胞阻滞在G1期,增殖有明显抑制(P<0.05);而干扰FAT10过表达eEF1A1组较干扰FAT10组、干扰eEF1A1组有明显的恢复(P<0.05)。Transwell侵袭实验结果显示,分别干扰FAT10和eEF1A1后与对照组细胞相比,肿瘤细胞的侵袭能力均有明显抑制(P<0.05),但过表达eEF1A1后,这种抑制作用并没有得到恢复。二、FAT10可以抑制eEF1A1的泛素化降解。通过免疫共沉淀确定FAT10和Ub与eEF1A1的II和III结合域相结合;进一步将eEF1A1分成大小不同的截短体,通过免疫共沉淀确定FAT10和Ub与eEF1A1的284-332和394-462两个片段相互作用;最后通过点突变技术和免疫共沉淀确定eEF1A1的290、313、318、330、395、408、439、443、444、450、453、457、460和462十四个赖氨酸位点在与FAT10和Ub结合中起重要作用。三、确定FAT10和泛素与eEF1A1结合相同位点,并存在相互竞争拮抗作用。并证实Ub和eEF1A1复合物能够被26S蛋白酶体亚基Rpn10所识别,而FAT10和eEF1A1复合物却不能与26S蛋白酶体亚基Rpn10结合,从而保护eEF1A1不被泛素-蛋白酶体降解。结论:FAT10与eEF1A1的结合拮抗其泛素化降解,进而稳定eEF1A1蛋白,最终影响肿瘤细胞的生物学特性。Rpn10识别FAT10/底物蛋白复合物是决定FAT10降解或稳定的底物蛋白的关键。对阐明FAT10在肿瘤细胞中的作用机制具有重要意义,为进一步明确肿瘤的发生发展机制提供理论依据,并为人们提出合理的预防和治疗方案奠定理论基础。