金针菇富含丰富的氨基酸、蛋白质和维生素等营养物质,是深受广大消费者欢迎的食用菌之一,拥有广阔的消费市场和开发前景。金针菇属于低温结实菌类,其子实体的发育需要经过低温诱导。金针菇的这一特点增加了金针菇工厂化栽培的能耗,因此,开展对金针菇子实体生长发育机理的研究,揭示金针菇子实体发育过程中的关键基因,对于定向改造金针菇基因组,培育高温型的金针菇菌株具有重要的科学意义和应用价值。本研究通过对金针菇在菌丝营养生长阶段和低温诱导下原基发育阶段的转录组进行测序分析,结合已有关于金针菇生长发育相关的研究报道,选择特殊转录因子以及子实体发育过程中重要信号传导途径中的差异表达基因为目标基因,借助最新的基因组编辑工具CRISPR/Cas9系统,通过构建基因敲除表达载体,转化金针菇原生质体,以期能探究这些差异表达基因在金针菇子实体发育过程中的具体作用功能。主要研究结果如下:1.以金针菇Fv-Yx菌株菌丝和原基转录组数据分析为依据,从大量的差异表达基因库中筛选出转录因子Mads8基因、c AMP传导途径基因N1477和双组分信号传导重要激酶基因HK535共3个差异表达基因,通过设计特异性引物,从金针菇Fv-Yx菌株的c DNA中成功克隆得到差异表达基因Mads8和N1477基因,通过对金针菇转录组数据分析,电子克隆得到差异基因HK535基因;(1)基因Mads8全长486 bp,菌丝中表达量为9.4228,在原基中表达量为30.0386,原基菌丝的对数比值为1.67,原基中明显上调表达;(2)基因N1477全长906 bp,在菌丝中表达量为469.3943,在原基中表达量为15.1009,菌丝和原基表达量相差30倍,原基菌丝的对数比值为-4.96,原基中明显下调表达。(3)基因HK-535全长750 bp,菌丝中表达量为8.205,在原基中表达量为19.6832,原基菌丝的对数比值为1.26,原基中明显上调表达;2.共转化g RNA表达载体构建。通过g RNA在线设计分析网站http://crispr.dbcls.jp/对目标基因Mads8、N1477和HK-535序列进行分析,以H1为启动子,分别选择了特异性的靶位点序列GTGGCAGGGAACGCGTGAAAAGG、GTCTGTCCGACGTGCGAGCGTGG和GCCCGACCATGGCACGACACAGG,成功构建了g RNA表达载体pg RNA-Mads8、pg RNA-N1477和pg RNA-HK535。3.单转化表达载体构建。以质粒pg Fvs-Cas9(含有金针菇gpd启动子和Cas9基因)为框架,采用PCR扩增和单酶切连接的方法,整合g RNA表达载体pg RNA-Mads8、pg RNA-HK535到质粒框架pg Fvs-Cas9,成功构建了重组载体pg Cas9-Mads8和pg Cas9-HK535,重组载体整合了Cas9基因和目标基因g RNA完整表达框。4.金针菇Fv-Yx单核体的筛选及对潮霉素敏感性测定。采用原生质体法制备金针菇单核菌株,通过出菇实验选择金针菇单核菌株Fy74作为本实验研究材料,对菌株Yy-74的菌丝和原基进行潮霉素敏感性测定,最终均选择50μg/m L的浓度作为拟转化子菌丝和原基筛选的浓度。5.表达质粒共转化金针菇单核体Fy74原生质体。采用PEG介导法把表达质粒pg RNA-Mads8、pg RNA-N1477和pg RNA-HK535分别与本实验室构建的表达质粒pg Fvs-Cas9共转化进金针菇原生质体细胞中,通过潮霉素筛选培养基的筛选,分子鉴定后分别获得了4株、5株和3株拟转化子。6.重组表达载体单转化金针菇单核体Fy74原生质体。采用PEG介导法把重组表达质粒pg Cas9-Mads8和pg Cas9-HK535单转化进金针菇原生质体细胞中,通过潮霉素筛选培养基的筛选,分子鉴定后均获得了2株拟转化子。7.转化子靶位点基因序列的敲除验证。对上述获得16株阳性转化子进行靶位点基因序列的敲除验证,均未发生基因突变。