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[目的]细菌感染引起的疾病日益威胁着人类的健康,造成的死亡威胁也不容小视,同时,细菌的耐药性问题正日益受各国政府的普遍重视,抗生素类药物的不当使用已经对社会、经济以及公共卫生造成了一定影响。有效治疗和控制这类疾病的关键在于,能够在治疗前快速、灵敏、特异地给出细菌及其耐药情况的检测结果。本研究的目的是建立一种能同时检测幽门螺杆菌克拉霉素(23S)、喹诺酮(gyrA)耐药位点和人PPI代谢相关CYP2C19的基因多态性情况的可视化基因芯片检测方法,为临床用药提供快速、有效的实验室依据,在临床诊断前给出相应的用药指导,针对性地选择药物进行个体化用药,保证治疗成功率,同时减少抗生素滥用带来的不良反应和资源浪费。 [方法]选择CYP2C19*2、CYP2C19*3、23S-2142、23S-2143、gyrA-87、gyrA-91为检测靶基因。优化人胃粘膜中,人与幽门螺杆菌基因组的提取方法,设计特异性引物;通过对引物比例、体系成分、杂交条件等的调节来优化四重PCR反应体系;筛选特异性探针;优化酪胺信号放大体系及反应条件等以期提高基因芯片检测信号的特异性和灵敏度。构建人CYP2C19*2、CYP2C19*3野生型和突变型质粒作为人基因组质控参考品和标准品;使用国际标准株26695作为细菌基因组质控参考品,在100份菌株中筛选出包含各个野生、突变位点的4株作为细菌基因组标准品。通过对大量野生和突变菌株的杂交及测序结果筛选比对,确定芯片的判读标准。根据此标准筛查196份经细菌培养的临床胃粘膜样本,对比细菌培养结果和50份随机抽取样本的测序结果,对检测芯片的基本性能指标,如特异性,灵敏度,重复性进行评价。 [结果]由选择的靶基因筛选出了4对特异性引物和15条SNP探针。确定了菌株及胃粘膜最合适的基因组DNA提取方法为一步直接煮沸法。成功构建了人基因组相应野生和突变型质粒,筛选出了细菌各耐药位点的野生型和突变型菌株,同时确定了芯片的判读标准。最佳四重PCR体系为:CYP2C19*2与CYP2C19*3,两对引物的标记引物与非标记引物的比例均为1:10,CYP2C19*2与CYP2C19*3的非荧光引物的终浓度均为0.12μmol/L,23S与gyrA,两对引物的标记引物与非标记引物的比例均为1:1,23S与gyrA的非荧光引物的终浓度分别为0.1μmol/L、0.2μmol/L,镁离子浓度为2.0mmol/L;Taq酶浓度为2.0U;dNTPs浓度为196μmol/L。优化后的PCR反应条件为预变性95℃,15min;变性95℃,20s;退火延伸65℃,60s;延伸72℃,5min。最佳杂交液组分为:2×SSC、1.2％SDS、5%甲酰胺。构建了人基因组CYP450-2C192、2C193野生和突变型质粒作为标准品,同时用四重PCR体系分析100份培养菌株,筛选了幽门螺杆菌野生型和突变型标准品。芯片可以检测出不低于103CFU/ml的幽门螺杆菌和不低于2ng/μl的人基因组DNA。对标准品分别进行测序验证,准确率均达100%。在此基础上通过统计学软件对每组探针进行判读标准的确定,然后对196份临床胃粘膜样本基因组DNA检测,随机测序验证准确率均在80%以上,批间批内变异系数CV值均小于15%。 [结论]本研究建立了一种高通量、高灵敏度、高特异性的可同时分析幽门螺杆菌克拉霉素、喹诺酮耐药位点和PPI代谢相关人CYP2C19的基因多态性的可视化基因芯片检测方法。能够在幽门螺杆菌三联疗法前,不经培养通过一次实验给出H.pylori对克拉霉素和喹诺酮的耐药信息及PPI代谢情况,结果可靠、操作简单易行、成本低,为临床医生针对性地选择药物进行个体化用药、保证治疗成功率提供了依据,从而减少了抗生素滥用带来的不良反应和资源浪费,在H.PYLORI感染快速诊断和耐药评价中具有较强的可行性。同时此方法也可以提高疾控部门的检测效率,为幽门螺杆菌的流行病学积累更丰富的数据。