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核桃的早实基因是一份珍贵的自然资源,研究核桃早实基因的遗传规律,寻找与其相连锁的DNA分子标记,不仅对于核桃育种和栽培实践,而且对于揭示木本植物童期发育的机理都有重要意义。近年来的研究表明,核桃的早实特性的遗传是数量性状遗传,有分离现象,是由多基因控制的性状。本研究以早实核桃优系绿园和晚实优系绿丰的F1代杂种后代以及部分核桃品种为试材,以RAPD标记OPB-08958定位核桃早实基因,计算该标记与核桃早实基因间的遗传距离,对该标记进行克隆测序及序列分析,并将该特异标记转化为SCAR标记;还初步确立了适于核桃的SRAP标记的反应体系。主要结果如下:①核桃基因组DNA的提取本研究证明改良的CTAB法是适合核桃基因组DNA提取的快速、简便的方法。该方法提取的核桃基因组DNA条带清晰,亮度均一,纯度较高,没有明显拖尾,无RNA,酶切反应均能被完全切开,酶切产物均一,酶切反应彻底,说明用本法提取的基因组DNA从质量和数量上都可以满足进一步研究的需要。②RAPD特异标记在亲本与杂交F1后代中的分离状况分析RAPD特异标记OPB-08900在早实亲本绿园上扩增出一条约900bp的特异性条带,而在晚实亲本绿丰上则无此条带;对于70株早实后代,有69株出现该条带,1株未出现(5号);84株晚实后代中,82株未出现该条带,2株出现(18号、108号)。χ2检测显示,供试杂交群体早实和晚实性状的分离比例符合1:1的分离比例,标记OP-B08900与早实性状共分离。在154株杂交F1后代中,共有3株表现为重组类型,则其重组率为1.95%。利用Haldane函数M=–㏑(1-2r)/2,计算得标记与核桃早实基因间的遗传距离为1.99cM,表明RAPD标记OPB-08900与核桃早实基因相连锁。③RAPD特异标记的回收、克隆、测序及序列分析本研究对RAPD特异标记片断OPB-08900进行了回收,并将回收产物与质粒PMD18-T连接,转化大肠杆菌JM109菌株感受态细胞,涂在预先涂布X-Gal/IPTG的含Amp的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选,克隆了该片断。对该片断进行测序,结果显示序列大小为958bp,提交GenBank,登录号为DQ673614。运用序列分析软件DNAMAN进行序列分析,表明该片断共有36个酶切位点,不具有基因的结构,应属于与核桃早实基因紧密连锁的DNA片断。在NCBI上特异标记DNA序列的同源性进行了比较,结果发现在GenBank中有26条来自于其它生物的DNA序列和DQ673614序列有部分相似性,但相似性位点片段大小大都在27-30bp之间,E值为0.002-7.0﹥﹥1×10-5,同源性较小说明特异标记OPB-08958的DNA序列为核桃基因组所独有。④SCAR标记的转化分析根据测序结果,在原有的OPB08随机引物及其互补序列基础上,设计了SEA、SEB两对SCAR引物,经检验,引物SEA在退火温度56℃条件下,对反应条件、反应体系如Taq酶、Mg2+、模板和引物的浓度等不敏感,重复性好,可以用于分子辅助育种的鉴定与选择。SEA在早实亲本及品种上扩增出和OPB-08958大小相似的条带,在晚实亲本及品种上则无此条带。检测其在杂交F1后代中的分离状况,发现与RAPD标记相一致。对该SCAR标记进行回收、克隆以及测序,与RAPD标记OPB-08958大小一致,表明本研究成功的将与核桃早实基因相连锁的RAPD标记OPB-08958成功转化为SCAR标记。⑤适于核桃的SRAP标记反应体系的确立分析本研究初步确立了适于核桃的SRAP标记反应体系,并利用不同引物组合对核桃早实和晚实亲本进行了SRAP-PCR扩增,挑选出一个多态性比较高的引物组合Em10-Me4对20株杂交后代上进行了检测,引物组合Em10-Me4在这20株杂交后代个体上共产生196条DNA条带,其中多态性条带为107条,多态性比率达54.6%,这说明SRAP标记适用于核桃遗传多样性的分析。