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香蕉属芭蕉科(Musaceae)、芭蕉属(Musa),是热带、亚热带地区重要的食品作物之一,具有很高的经济价值。但是近年来由于香蕉病害逐年严重,寒害、旱害时常发生,使得香蕉生产遭受严重损失。因此,培育出抗病、抗逆的优质香蕉新品种,成为世界香蕉产业所面临的迫切问题,而常规的杂交育种又由于多数香蕉栽培种是三倍体,具高度不育等特性不易实现。利用生物技术方法,如基因工程、体细胞突变和体细胞杂交等,可望实现改良香蕉种质的目的。而所有这些技术的应用都有赖于胚性细胞悬浮培养及其高效的植株再生体系的建立,因此,挖掘合适的胚性细胞分子标记来识别己获得胚性能力的细胞对于建立有效的再生体系有着重要的意义。目前研究表明,体细胞胚胎发生受体蛋白激酶(SERK,somatic embryogenesis receptor kinase)基因可以作为多种植物的胚性分子标记,而该基因是否可作为香蕉的分子标记还未见报道。
本论文,采用半定量RT-PCR的方法,初步研究了可作为外植体的大蕉(MusaABB,cv.Dajiao)各组织中SERK基因的表达模式,并选择大蕉假茎薄片为外植体,比较在MB<,5>+10μmol/L Dicamba、MB<,5>+27 μmol/L 2,4-D和MS1培养基中所诱导的愈伤组织中SERK基因的表达,同时在本实验室已建立的花序外植体胚性细胞悬浮培养体系的基础上,进一步研究大蕉胚性悬浮系中体细胞胚胎发生能力的变化和SERK表达的关系,试图确定SERK基因表达与香蕉细胞胚性潜能的关系。取得结果如下:
1、半定量RT-PCR法检测SERK基因的表达,发现该基因在大蕉的果实、果皮、未成熟花序和组织培养苗的根、假茎、叶中均有表达,但花序中该基因的表达明显比其他组织器官中的强。这与目前认为花序是用于胚性愈伤组织诱导的理想的外植体研究结论相吻合。
2、以大蕉组培苗假茎薄片为外植体分别在MB<,5>+10μmol/L Dicamba、MB<,5>+27μmol/L 2,4-D和.MS1三个培养基上培养一个月诱导出不同的愈伤组织用于SERK基因的表达分析。MB5含B5基本盐+改良维生素/氨基酸混合物+1 μmol/LIAA。MS1培养基含MS基本盐+8.28μmol/L Picloram+5.71 μmol/L IAA+13.43 μmol/L NAA。愈伤组织的诱导和继代培养都在黑暗条件下进行。在含10μmol/LDicamba的MB<,5>培养基上所形成的是黄色、松脆、含水量高的愈伤组织(诱导率为95﹪);在含27μmol/L 2,4-D的MB<,5>培养基上可诱导出无色、柔软、含水量高的愈伤组织(诱导率为92﹪)。这两种愈伤组织在原来的培养基上继代培养30天后,大部分褐化死亡。但在MS1培养基上诱导的是黄色、颗粒状、粘性较大的愈伤组织(诱导率为85﹪),在原培养基上经1个月的继代培养后,进一步在悬浮培养基上悬浮培养60天产生球形、具有胚性特征的细胞和类体胚结构的培养物,同时结合该愈伤组织的形态特征、细胞学和组织学的观察,证实在MS1培养基上所诱导愈伤组织为胚性愈伤组织。比较在这3个培养基所诱导产生的愈伤组织中SERK基因的表达发现,MS1培养基上所诱导的胚性愈伤组织的SERK基因表达比其他两种非胚性的愈伤组织的强。可见,SERK基因的表达与大蕉体细胞胚性潜能的获得和胚性愈伤组织的形成有密切相关。
3、以来源于花序外植体的大蕉胚性愈伤组织所建立的胚性细胞悬浮培养体系为材料,在悬浮培养的150天中,每30天取一定量的胚性悬浮细胞,在体胚诱导培养基中培养60天诱导体胚发生,同时冻存部分细胞用半定量RT-PCR测定SERK基因的表达,结果发现这个基因在培养过程中都有一定水平的表达,到90天时表达最强,随后逐渐减弱。SERK基因的表达模式与该悬浮细胞的体胚发生能力的变化趋势一致,表明大蕉胚性悬浮细胞培养过程中,SERK基因表达与细胞胚性潜能的表达和体胚形成呈正相关。
综上,SERK基因的表达具有组织特异性,与大蕉组织培养物的胚性潜能的获得及其表达呈正相关,可作为这些培养物的胚性分子标记。