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乳腺肿瘤的精准分型诊断在乳腺肿瘤个性化治疗方案的选择上具有极其关键的作用。目前,建立在肿瘤组织中生物标志物差异性表达基础上的乳腺肿瘤分型诊断的精准性不足,不能满足临床治疗的需要。主要体现在两个方面:一是乳腺肿瘤分型诊断的金标准技术免疫组织化学（IHC）操作复杂、成本高、费时、费力且严重依赖于操作人员的经验,很大程度上影响了诊断的准确性,容易出现误诊或者漏诊;二是现有肿瘤生物标志物特异性不强,不能满足乳腺肿瘤精准分型的需要。因此,需要发现新的特异性更强的生物标志物以对乳腺肿瘤进行更深入和更精准的分型。作为一种新兴的核酸基分子探针,核酸适配体是在体外经SELEX技术筛选得到的一种类似于抗体的短单链核酸片段,其在很多性质上类似于抗体并优于抗体,如其分子靶标广、特异性和亲和力强、生产成本低、易化学修饰、性质稳定、无免疫原性等。以细胞为靶标的Cell-SELEX技术更是可以在具体分子靶标未知的前提下筛选与特定靶细胞特异性结合的核酸适配体,可以作为分子探针和识别配体用于相应疾病的鉴别诊断和靶向治疗,同时也可以用于靶细胞上生物标志物的鉴定,从而发现新的生物标志物。基于此,本论文在传统Cell-SELEX技术只采用一种对照细胞进行反筛的基础上,采用多种对照细胞进行反筛的多重反筛Cell-SELEX技术以Luminal A型的乳腺肿瘤细胞MCF-7为靶细胞,HER2阳性型的乳腺肿瘤细胞SK-BR-3、三阴性型的乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A为对照细胞,筛选MCF-7乳腺肿瘤细胞特异性的DNA核酸适配体,希望为乳腺肿瘤的精准分型诊断提供一种新的工具并在此基础上对核酸适配体的分子靶标进行鉴定,为乳腺肿瘤的高效、精准分型诊断和靶向治疗提供新的生物标志物和治疗靶点。本论文的主要内容如下:1.MCF-7乳腺肿瘤细胞特异性核酸适配体的筛选及鉴定利用多重反筛Cell-SELEX技术以Luminal A型的乳腺肿瘤细胞MCF-7为靶细胞,HER2阳性型的SK-BR-3细胞、三阴性型的MDA-MB-231细胞和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A为对照细胞,经过17轮筛选获得特异性结合MCF-7细胞的次级文库。经克隆和测序分析后共获得10条候选核酸适配体序列并从中鉴定得到四条能够与靶细胞MCF-7稳定结合的核酸适配体序列。2.核酸适配体的性质考察及在乳腺肿瘤分型诊断中的应用系统考察了上述四条核酸适配体的特异性和亲和力并从中甄选出特异性最好、亲和力较高的核酸适配体MF3,其与靶细胞MCF-7结合的Kd值为82.25±25.14 n M。进一步研究了温度和酶消化作用对其与靶细胞MCF-7结合能力的影响及其稳定性。核酸适配体MF3在4°C、25°C和37°C三个温度条件下都能与靶细胞MCF-7结合良好;在靶细胞MCF-7细胞膜上的分子靶标是一种细胞膜蛋白;在含10%FBS的1640细胞培养基中于37°C条件下能够稳定保存约4 h优于随机文库的稳定性（约2 h）。本工作进一步将核酸适配体MF3应用于乳腺肿瘤分子亚型的鉴别诊断。结果表明,核酸适配体MF3能够鉴别:（1）MCF-7细胞和SK-BR-3、MDA-MB-231以及MCF-10A细胞,由于这四种细胞分别属于Luminal A型、HER2阳性型、三阴性型乳腺肿瘤细胞和正常乳腺上皮细胞,因此核酸适配体MF3具有特异性鉴别这三种乳腺肿瘤亚型和正常乳腺组织的潜力;（2）MCF-7细胞的移植瘤与MDA-MB-231、SK-BR-3细胞的移植瘤及其组织切片;（3）Luminal A型临床乳腺肿瘤组织和Luminal B（HER2+）型、HER2过表达型和三阴性型临床乳腺肿瘤组织以及癌旁组织和正常乳腺组织。3.核酸适配体的截短优化及在乳腺肿瘤分型诊断中的应用根据核酸适配体的二级结构系统地截短优化了核酸适配体MF3,得到序列长度为58 nt的截短核酸适配体MF3Ec。截短核酸适配体MF3Ec同样具有在细胞、组织和动物模型中鉴别Luminal A型乳腺肿瘤和HER2阳性型、三阴性型乳腺肿瘤的潜力。在临床乳腺肿瘤组织切片的检测研究中,MF3Ec也表现出与原始序列MF3类似的鉴别诊断效果,其能够鉴别Luminal A型临床乳腺肿瘤组织切片与Luminal B（HER2+）型、HER2过表达型、三阴性型、癌旁组织和正常乳腺组织的临床组织切片。相比于原始序列MF3,截短优化后的核酸适配体MF3Ec具有更高的亲和力,其与靶细胞MCF-7结合的亲和力约是MF3的4倍,Kd值达到了18.95±2.90 n M。其次,MF3Ec较MF3的稳定性更强,MF3Ec能够在含10%FBS的1640细胞培养基中稳定保存约12 h,远大于MF3的约4 h。同时,MF3Ec比MF3具有更好的肿瘤靶向性和更长的肿瘤部位滞留时间,其能够在MCF-7细胞荷瘤小鼠的肿瘤部位滞留大约5 h,长于MF3的约3 h。在对临床乳腺肿瘤组织切片的免疫荧光检测中,核酸适配体MF3Ec也具有更好的表现,其对Luminal A型乳腺肿瘤组织检测的阳性率达到了81.82%,高于MF3的70%。因此,截短优化后的核酸适配体MF3Ec比原始序列MF3具有更好的性能和更具临床应用潜力。4.基于核酸适配体的乳腺肿瘤生物标志物的发现和鉴定利用基于核酸适配体的蛋白pull down技术成功捕获和纯化到核酸适配体MF3Ec在MCF-7细胞膜上的分子靶标。随后,通过质谱分析、WB检测和RNA干扰等技术手段证明核酸适配体MF3Ec的特异性分子靶标为细胞膜表达的PHB2蛋白。细胞膜表达的PHB2蛋白可能是一种潜在的Luminal A型乳腺肿瘤特异性表达的生物标志物,为临床乳腺肿瘤的精准分型诊断和靶向治疗提供了新的分子依据和治疗靶点。