前言 血管新生在实体肿瘤生长、侵袭和转移的过程中起着至关重要的作用。肿瘤的血管新生通常以肿瘤内微血管密度(iMVD)表示，它是决定肿瘤大小、转移和病人预后的关键因素，与早期肿瘤转移、播散有关。研究发现新生血管的形成与肿瘤细胞分泌和激活的血管生长因子有关。血管内皮生长因子(VEGF)／血管通透因子(VPF)特异地作用于血管内皮细胞，促进肿瘤的血管新生，增加血管通透性，促进肿瘤细胞转移、播散，是最重要的血管新生刺激因子之一。 肿瘤是一种细胞周期性疾病，恶性肿瘤的本质在于细胞周期调节失控，细胞呈无限制的自主增殖和分裂。在适宜的刺激因子(如癌基因、生长因子)作用下，细胞即被激活从静止状态进入增殖状态。以细胞增殖指数(proliferatim index，PI)表示细胞的增殖状态，其值越高提示肿瘤细胞增殖越快。 最近，国内外报道了VEGF、血管新生在非小细胞肺癌的发病、治疗和预后中的作用。而对小细胞肺癌研究很少，本实验采用免疫组织化学技术和流式细胞学技术，对33例小细胞肺癌(SCLC)标本中VEGF表达及其与血管新生和肿瘤细胞增殖指数、临床资料之间的关系进行了研究，以明确小细胞肺癌是否高表达VEGF，以及VEGF、血管新生在小细胞肺癌发病过程中是否起重要作用。 材料和方法 1．对象及分组 1．1材料：选择1998年1月至2003年6月中国医科大学附属第二医院33例小细胞肺癌手术切除石蜡包埋标本，男20例，女13例，年龄35～67岁，平均51.72岁。患者术前未经化疗、放疗及其他抗癌治疗。组织学诊断采用1981年WHO肺癌组织学分类标准，TNM分期参照1997年UICC肺癌分期标准。各病历均详细记录患者年龄、性别、吸烟史、瘤体大小、TNM分期、淋巴转移情况。随访持续到2003年12月，对21例病人术后随访20个月，其中巧例发生复发或远处转移。 1.2分组:由于病例有限，将I、n期归为临床早期，111、W归为临床晚期;瘤体大小以3 cm为界分两组;有淋巴结转移为转移组余为非转移组。 1 .3对照:8份肺部良性肿瘤组织石蜡包埋标本。 2.免疫组化方法检测VEGF表达采用S一P法染色，步骤如下:石蜡切片常规脱蜡至水，内源性过氧化物酶阻断10分钟，高温高压抗原修复，非免疫动物血清温育20分钟(37℃)，一抗温育过夜(4℃)，二抗温育20分钟(37℃)，链亲和素—过氧化物酶温育30分钟(37℃)，，DABZ一5分钟显色，苏木素对比染色后，脱水，透明，封片。光镜下观察，同时观察癌旁组织并记录。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片同一条件下染色为阳性对照。阳性细胞染色为棕黄色颗粒或团块，特异性位于细胞浆或细胞膜。计算每例切片5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率。综合染色强度及分布范围进行半定量处理:染色强度分无着色O分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。分布范围分阳性细胞数<10%为O分，n%一30%为1分，31%一60%为2分，60%以上为3分。两者相加最大为6，>2即为阳性。VEGF评分分级:O一2分为阴性，3一4分为低级，5一6分为高级。 3.肿瘤内微血管密度(iMVD)按文献用Weidener方法计数。抗CD34单抗表达于血管内皮细胞。每一标本先在低倍镜Xloo(X10物镜和X10目镜)下选3个微血管数最多的区域即“亮点”，在每一亮点中计数高倍镜XZoo(X10目镜和XZO物镜)下的微血管数，取其3个均值计为iMVC。 4.流式细胞术单细胞悬液的制备:取33例SCLC患者标本，先将石蜡包埋组织切成40一50林m厚的切片，二甲苯脱蜡;依次置人100%，90%，70%，50%的乙醇中水化，每步10分钟;去乙醇，加人3一5毫升蒸馏水，漂洗3一5分钟后弃上清;加人0.5%胃蛋白酶消化液5毫升，置37℃水浴30分钟，5一10分钟震荡一次;加人生理盐水5毫升，终止消化;经300目尼龙网过滤;离心巧oor/而n，5分钟，弃上清;再以生理盐水漂洗1一2次;悬浮细胞并缓慢加人4℃，70%乙醇固定，4℃冰箱保存。 5.流式细胞术进行细胞周期分析取乙醇固定的细胞悬液，离心去乙醇，冷PBs洗二次，调整细胞密度1 x106个/毫升，有27例达到标准，加入RNA酶1毫升，37℃水浴，消化30分钟，离心弃RNA酶，冷PBS洗一次，加人含碘化丙吮的PBso，5毫升闭光染色20分，PBS重新悬浮细胞，300目尼龙网过滤，上机检测。以增殖指数(Pmh反ration index，PI)表示细胞的增殖状态:Pl=(GZM+s)细胞数+(G。;+qM+S)细胞数。 6.统计:应用SPSS统计分析软件，进行x，检验，方差分析，秩和检验和孙~等级相关分析结果 1.免疫组织化学 33例小细胞肺癌患者中有21例vEGF阳性表达，阳性率63.34%，胞浆显示棕黄色，阳性细胞数一般大于60%。8例对照组标本有一例阳性，阳性率12.5%，但阳性程度较SCLC标本弱，阳性细胞数较少。两者对比有显著差异，P<0.05。本组SCLC病例VEGF表达水平与淋巴转移和TNM分期有关，各组间VEGF表达差异有显著性(P<0.05)。 SCLC组织中以CD34标记的iMVD为18.70叻149.3(M=66.43)/x200。以66/x 200为界分为高低两组。其中有20例SCLC属高级组，占60 .61%。而对照组标本中iMVD为0‘36.01(M二18.23