马氏珠母贝和华贵栉孔扇贝精子的游泳运动学特征及超低温保存技术研究

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由于环境破坏及人工定向选择等原因海洋双壳贝类种质衰退现象日益严重,双壳贝类种质复壮、保存等工作迫在眉睫,建立海洋生物种质资源库对我国海洋生物资源开发利用具有重大意义。本文以马氏珠母贝和华贵栉孔扇贝为研究对象,对精子游泳运动特征、体外激活条件、低温短期保藏和超低温长期储存技术进行研究,以期推动发展马氏珠母贝和华贵栉孔扇贝遗传育种、种质保存、人工繁殖技术,助推中国海洋生物种质库的建立及利用。1.马氏珠母贝精子游泳运动为“短跑型”,华贵栉孔扇贝精子为“马拉松型”。马氏珠母贝精子不可直接被海水激活,氨海水激发其游泳运动,2mM氨海水激活后持续激烈运动5.5 min,总运动率(total motility,TM)为89%、快速运动精子比例(thepercentageofrapaidsperm,RAP)为 60%、曲线运动速率(curvilinearvelocity,VCL)为 141 μm/s、直线运动速率(straight-linevelocity,VSL)为 115 μm/s、平均路径速率(average path velocity,VAP)为 127 μm/s、头部位移距离(lateral head displacement,ALH)为 2.0 μm、鞭毛摆动频率(beat-cross frequency,BCF)为 12 Hz;华贵栉孔扇贝精子被海水激发游泳运动,持续激烈运动22min,TM为84%、RAP为 5 8%、VCL 为 168 μm/s、VSL 为 129 μm/s、VAP 为 148 μm/s、ALH 为 1.5 μm、BCF 为 12 Hz。2.离子铵是催化马氏珠母贝精子游泳运动的主要因素,pH或盐度的变化不会显著激活马氏珠母贝精子运动。2mM或3mM氨海水是精子运动最佳激活溶液,激活后30 s内进入完全激活状态(full activation,FA),期间TM为90%,VCL平均为143μm/s、VSL平均为110μm/s、VAP平均为13μm/s、BCF平均为10 Hz。。3.无钙生理缓冲液(Ca-free Hanks’ balanced salt solution,Ca-free HBSS)对马氏珠母贝和华贵栉孔扇贝新鲜精子具有较佳的活力抑制作用,可作为精子稀释液及短期保存液使用。4℃条件下马氏珠母贝精子活力低温保藏有效期为24 h,2 mM氨海水激活后 TM 为 70%、VCL 为 126μm/s、VSL 为 106 μm/s、VAP 为 125 μm/s、ALH为1.76μm、BCF为9Hz;华贵栉孔扇贝精子活力低温保藏期为8h,经自然海水激活后 TM 为 83%、VCL 为 150 μm/s、VSL 为 123 μm/s、VAP 为134 μm/s、ALH为1.74μm、BCF为11 Hz。冷藏精子在保藏有效期内活力可等同于新鲜精子使用。4.开发了一套马氏珠母贝精子程序性超低温保存技术方案:以人工解剖法获得TM65%以上的新鲜精子,用Ca-free HBSS稀释,以10%-15%丙二醇(PG)和15%乙二醇(EG)为冷冻保护液,冰上平衡3 min后以10℃/min从0℃降至-50℃,在-50℃下保持1 min后投入液氮,至少储存2 h。精子解冻后TM>65%、VCL>50 μm/s、VSL>20 μm/s、VAP>40 μm/s、ALH>1.10μm、BCF>4.40 Hz、受精率>35%,冷冻保护效果良好。5.开发了一套华贵栉孔扇贝精子程序性超低温保存技术方案:以人工解剖法获得TM70%以上的新鲜精子,用Ca-free HBSS稀释,以5%-10%二甲基亚砜(DMSO)为冷冻保护液,冰上平衡2 min后以10℃/min从0℃降至-80℃,在-80℃下保持2 min后投入液氮,至少储存2h。精子解冻后TM>30%、VCL>90μm/s、VSL>16μm/s、VAP>18 μm/s、ALH>1.10 μm、受精率>26%,冷冻保护效果相对较好。
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