目的:建立中国地鼠口腔黏膜癌动物模型,根据WHO的分级标准将动物模型中口腔黏膜癌的发展分为四个阶段:正常阶段(normal stage),单纯增生阶段(simple hyperplasia stage),异常增生阶段(abnormal hyperplasia stage),鳞癌阶段(squamous cell and invasive carcinoma,cancer);运用高通量测序技术和实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对中国地鼠口腔黏膜癌发生发展过程中的各个阶段进行测序并验证测序结果,构建各阶段microRNA(miRNA)表达谱,并预测其靶基因,进一步采用生物信息学的方法对其进行功能分析,筛选出癌变过程中可能发挥重要作用的关键GO条目、信号通路及可能的生物标志物。此外,通过体外细胞实验进一步明确候选基因miRNA-181a-5p对人类口腔鳞状细胞癌细胞系Tca-8113和CAL-27生物学行为的影响,并对其靶基因和下游相关互作基因进行验证。从非编码RNA层面和基因表达的角度深入探究口腔鳞状细胞癌形成过程中可能存在的调控机制,揭示候选miRNA在肿瘤细胞凋亡、周期、增殖、迁移及侵袭中所参与的信号通路,以期对临床治疗口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)具有指导意义。方法:本研究采用化学药物诱导法建立实验动物模型。首先,利用涂抹法将DMBA(9,10-Dimethyl-1,2-Benzanthracene,二甲基苯并蒽)以每周三次的频率均匀涂抹于中国地鼠口腔颊囊黏膜来建立中国地鼠口腔颊囊黏膜鳞状细胞癌的人类疾病动物模型。然后,根据WHO的分级规则将其分为正常口腔黏膜、单纯增生、异常增生、鳞状细胞癌四个阶段。采用miRNA-seq技术构建中国地鼠口腔黏膜癌四个阶段的miRNA表达谱,利用生物信息学方法分析各组中差异表达miRNA,进行GO与KEGG功能分析,并利用qRT-PCR技术对部分差异miRNA进行验证。在体外实验中,利用瞬时转染技术构建miRNA-181a-5p过表达与敲低表达细胞模型,每种细胞系各分为五组:control(空白对照组)、mimics(模拟物组)、mimic NC(模拟物阴性对照组)、inhabitor(抑制物组)、inhabitor NC(抑制物阴性对照组)。使用CCK8实验、Transwell实验及基质胶侵袭实验分别检测各组细胞转染后增殖、迁移和侵袭能力的变化;运用流式细胞技术检测细胞周期及凋亡变化。随后,通过miRNA靶基因预测工具预测miRNA-181a-5p可能的靶基因,并使用qRT-PCR验证靶基因的表达。最后利用qRT-PCR技术对miR-181a-5p/TIMP 1轴抑制口腔癌细胞系生物学行为的机制进行初步探讨。结果:成功构建中国地鼠口腔癌动物模型,病理检测结果显示:动物模型的口腔鳞状细胞癌形成过程,经历了由正常上皮、上皮单纯增生、上皮异常增生到鳞状细胞癌四个阶段。随后分别构建了各个阶段的miRNA差异表达谱,并对各组差异表达miRNA进行了深入的生物信息学分析。在上皮单纯增生、上皮异常增生以及鳞状细胞癌阶段分别筛选出77、76、76个显著差异的miRNA;交互分析显示,在单纯增生、上皮异常增生以及鳞状细胞癌阶段中分别独有3、2、10个显著差异的miRNA。各阶段差异miRNA的功能分析显示:上皮单纯增生、上皮异常增生与鳞状细胞癌阶段分别有11、10、42个条目与生物过程相关,24、36、18个条目与细胞组分相关,42、43、48个条目与分子组分相关。此外,各阶段显著富集的KEGG条目分别为107、107、110条。交互分析显示:在单纯增生阶段分别只存在3条细胞组分,2条分子功能,3条KEGG信号通路,无单独的生物过程;异常增生阶段中只存在4条细胞组分,2条分子功能和2条KEGG信号通路,无单独的生物过程;在鳞状细胞癌阶段,仅存在29条显著富集的生物过程,6条分子功能,9条KEGG信号通路,而无单独的细胞组分。最后我们发现miR-181a-5p在各阶段中表达丰度较高,与此同时其表达量在口腔癌形成的各阶段依次降低,所以选择miR-181a-5p作为后续功能验证的重点。体外细胞实验显示,高表达miR-181a-5p后可显著抑制Tca-8113细胞和CAL-27细胞的增殖、克隆形成、侵袭、迁移与周期,而对细胞凋亡具有显著的促进作用;然而,当抑制miR-181a-5p表达后呈现出与其高表达截然相反的结果。靶基因预测软件显示TIMP1为miR-181a-5p的潜在靶标之一,在后续的验证实验中发现与空白对照组和阴性对照组相比,miR-181a-5p模拟物组中,E-cadherin和Bax过度表达,而TIMP 1、MMP2、MMP9、Vimentin、Ki67、BCL2、cyclin D1、CDK6以及E2F1均表达下调。但在miR-181a-5p抑制剂组中,所有基因均呈完全相反的表达趋势。推测miR-181a-5p/TIMP 1轴可能通过影响增殖、迁移侵袭以及周期凋亡相关基因的表达从而调控口腔癌细胞的生物学行为。结论:本研究利用涂抹法成功构建了正常上皮、上皮单纯增生、上皮异常增生、鳞状细胞癌四个阶段的中国地鼠口腔颊囊黏膜癌人类疾病动物模型;并首次利用高通量测序技术对各阶段动物模型进行了测序和全面的生物信息学分析,获得并筛选鉴定出在中国地鼠口腔黏膜癌发生发展过程中的关键差异miRNA、关键GO条目及关键KEGG信号通路。体外细胞实验发现miR-181a-5p/TIMP 1轴可能是miR-181a-5p抑制口腔癌发生发展的重要信号通路,同时miR-181a-5p可能通过miR-181a-5p/BCL2/Bax信号转导轴来调控口腔癌细胞的凋亡。