血管性痴呆（Vascular dementia,VD）是指由各种类型的脑血管病引起的一种获得性高级认知功能障碍综合征。VD是引起痴呆的第二类疾病原因,约占所有痴呆的15-20%。然而,目前VD的治疗更侧重于控制潜在的心脑血管危险因素和治疗相关的伴随症状。对于VD,目前尚未有有效的治疗策略,因此,寻找一种高效的药物及探讨其可能的机制已成为医学研究的热点。研究证明,慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion,CCH）与VD的发生和发展有关。当CCH发生后脑组织出现氧和葡萄糖供应不足,进而导致一系列的稳态改变,包括氧化应激、凋亡、自噬等。最近的研究表明,CCH可导致大鼠海马神经元凋亡、自噬增强和再分布。我们的课题组在前期研究中已发现VD动物模型中存在氧化应激损伤,凋亡与自噬同时激活,加速神经元死亡。抑制VD大鼠中枢神经的自噬与凋亡的激活可能会起到神经保护作用。氢可快速地扩散到所有的细胞膜上,甚至很容易地穿透血脑屏障。Ohsawa等在2007年报道,气体氢气（H₂）通过选择性地还原细胞内的强氧化剂如羟基自由基（·OH）和过氧亚硝基阴离子（ONOO^-）,作为治疗性和预防性抗氧化剂,H2对氧化应激具有细胞保护作用。大量的证据表明,氢对许多疾病都有保护作用,在不同的脑损伤模型中亦是如此。分子氢在过去十年中得到了广泛的关注与研究,其发挥作用的机制包括有有抗氧化、抗凋亡及抗炎等作用。最近,有关氢与自噬关系的研究也越来越多。然而,氢对自噬的作用却存在争议。一些研究表明氢可以降低自噬,而另有一些表明氢可以诱导自噬。但到目前为止,尚未有氢对VD的保护作用的研究。因此,氢在CCH中的作用及其机理还有待进一步研究。基于上述背景,本研究采用永久性双侧颈总动脉闭塞法,即两血管闭塞（two-vessel occlusion,2VO）法建立大鼠CCH致VD模型,给予富氢水（hydrogen-rich water,HRW）灌胃,观察大鼠认知功能变化,观察HRW对海马氧化应激指标的影响,并进一步观察HRW对海马神经元形态学影响,以及对与细胞凋亡、自噬相关蛋白表达的影响。在此基础上,探讨HRW的神经保护作用与相关信号通路之间的关系。第一部分富氢水对慢性脑低灌注致血管性痴呆大鼠认知功能的影响目的:通过2VO方法建立CCH致VD大鼠模型,观察HRW对2VO术后4周大鼠认知功能的影响。方法:1.选取清洁级健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠共48只（3月龄）,体重200-250g,适应性饲养1周后,将大鼠随机分为4组,每组12只。假手术组（sham组）,模型组（model组）,富氢水组（HRW组）,阳性对照多奈哌齐组（Don组）。2.采用2VO法制备VD大鼠模型,HRW组术后次日给予一次性HRW灌胃3ml/次,此后连续给予每日一次,共给予4周,假手术组和模型组给予双蒸水灌胃3ml/次,多奈哌齐组给予多奈哌齐溶液1mg/kg,并用双蒸水补足3ml,每日给予一次,连续给予4周。3.最后一次给药的次日,每组随机选取10只大鼠,应用Morris水迷宫自动记录仪进行为期6天的行为学测试。前5天为定位航行实验,最后一天为空间探索实验。结果:1.定位航行实验各组大鼠平均逃避潜伏期随着训练天数的增加而逐渐减低。四组的逃避潜伏期总体之间具有显著性差异。模型组大鼠与假手术组相比,从开始第一天至第五天平均逃避潜伏期均明显延长（P<0.01）。在训练的第一、二天,HRW组大鼠平均潜伏期与模型组相比明显缩短（P<0.05）,而多奈哌齐组与模型组相比差异无统计学意义;直到第三、四、五天,HRW组及多奈哌齐组大鼠的平均逃避潜伏期比模型组明显缩短,其差异均具有统计学意义（P<0.01）,而且均以第三、四天缩短最为明显。HRW组在前四天大鼠的平均逃避潜伏期均略短于多奈哌齐组,在第五天略延长,然而在训练的这五天内两组的差异无统计学意义。2.空间探索实验结果显示各组大鼠之间在目标象限停留时间百分比具有显著性差异。与假手术组进行比较,模型组、HRW组及多奈哌齐组大鼠目标象限停留时间百分比显著缩短（P<0.01）。而与模型组比较,HRW组的大鼠,其目标象限停留时间百分比明显升高（P<0.01）,多奈哌齐组大鼠有相似的变化趋势（P<0.01）。HRW组和多奈哌齐组组间比较,大鼠在目标象限的停留时间百分比无统计学差异（P>0.05）。3.四组大鼠游泳轨迹的变化四组大鼠最初是采用随机的方式寻找隐蔽的平台,游泳轨迹一般为边缘式。而当训练天数增加后,假手术组、HRW组及多奈哌齐组大鼠逐渐开始转变游泳方式来寻找隐蔽的平台,逐渐转变至趋向式,甚至有的大鼠直线式寻找到平台,尤其是以假手术组变化寻台方式最为明显。而模型组大鼠的方式多为边缘式或为趋向式。小结:2VO法制备形成CCH致VD大鼠模型,出现明显的认知功能障碍,在一定程度上与临床VD的发病过程相似,是VD的理想动物模型。HRW可明显改善VD大鼠的认知功能。其对认知改善效果甚至可以与多奈哌齐相媲美。第二部分富氢水对血管性痴呆大鼠海马神经元细胞的保护作用及对抗氧化应激损伤的影响目的:通过观察2VO术后4周海马组织CA1区的病理形态学变化,大鼠海马超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）活性及丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量的变化,来探讨HRW是否具有自由基清除的作用。方法:1.行为学测试结束后,每组随机取3只大鼠,麻醉后,4%多聚甲醛灌注固定,常规石蜡包埋,冠状切片,采用尼氏染色的方法,在光镜下观察各组大鼠海马组织CA1区组织病理学改变;此外,每组随机取3只大鼠,麻醉后,用电镜灌注固定液灌注固定,制备大鼠海马CA1区电镜组织标本,并利用透射电镜观察海马CA1区神经元细胞超微结构的变化。2.此外,每组随机取6只大鼠,充分麻醉后,断头取材,分离海马,制备海马组织匀浆,应用试剂盒检测大鼠海马组织中MDA含量,SOD活性。结果:1.四组大鼠海马CA1区神经元尼氏染色实验的结果假手术组海马CA1区锥体神经元基本没有损伤表现。模型组大鼠海马存活的锥体神经元细胞数量明显减少,神经元丢失较明显,存在断裂带,甚至出现海马萎缩。且存活的神经元细胞核着色深,核仁模糊,而胞浆着色浅,部分胞体形态不规则,变小,甚至变为梭形或多角形,排列比较松散。HRW组及多奈哌齐组大鼠海马CA1区神经元损伤较轻,神经元丢失较少,细胞排列相对紧密,存活细胞边缘较清晰,结构相对完整,细胞形态无明显变小,皱缩现象减少,然而仍有少数细胞核固缩,着色深。2.四组大鼠海马CA1区神经元电镜超微结构结果假手术大鼠神经元超微结构完整,只有少量神经元内可见自噬小体。模型组大鼠可见较多自噬体堆积,线粒体肿胀,内质网松散,部分神经元细胞核膜边界欠清,染色质固缩、染色质边集。而HRW组与多奈哌齐组,两组中自噬体数量均有不同程度的减少,细胞核和细胞器微结构损伤较模型组明显缓解,然而与多奈哌齐组不同的是,HRW组线粒体肿胀改善欠明显。3.四组大鼠海马组织MDA含量测定结果2VO术后三组（模型组、HRW组、多奈哌齐组）MDA的含量均较假手术组增高,其中以模型组增高最为明显,具有统计学差异（P<0.05）;HRW组及多奈哌齐组的MDA含量比模型组均有所降低,但未达到统计学差异。4.四组大鼠海马组织SOD活性测定结果与假手术组相比,模型组SOD活性明显降低（P<0.05）,而HRW组SOD的活性比模型组明显升高（P<0.05）,接近甚至超过假手术组（P>0.05）;而多奈哌齐组SOD活性虽然比模型组略升高,但两组之间没有统计学差异（P>0.05）。小结:1.CCH损伤可引起大鼠海马组织CA1区神经元损伤,并出现凋亡改变。2VO手术可激活自由基生成系统,逐渐增强氧化应激反应。氧化应激可能是CCH引起VD的机制之一。2.HRW可以改善因CCH造成的海马组织CA1区神经元细胞损伤,减少细胞死亡数目,减少自噬小体数量,维持细胞形态完整,结构正常。HRW对线粒体的保护作用还不足以改善线粒体肿胀的现象。3.HRW能通过提高SOD活性,减少MDA含量,降低氧化应激反应,发挥神经保护作用。氢的抗氧化应激能力优于阳性药组。第三部分富氢水对血管性痴呆大鼠海马神经元细胞凋亡蛋白的影响目的:通过观察2VO术后4周海马组织有关细胞凋亡的相关蛋白:半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白水解酶-3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,cleaved caspase-3）、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白抗体（Bcl-2 associated X protein,Bax）蛋白表达水平的变化,进一步观察HRW对神经元凋亡的调控作用,探讨其神经保护作用的机制。方法:1.每组随机取3只大鼠,麻醉后,4%多聚甲醛灌注固定,常规石蜡包埋,冠状切片,采用免疫组化的方法,在光镜下观察各组大鼠海马组织CA1区cleaved caspase-3阳性细胞的表达。2.此外,每组随机取6只大鼠,充分麻醉后,断头取材,分离海马,应用蛋白质免疫印记的方法检测大鼠海马组织中Bcl-2、Bax蛋白表达的水平。结果:1.四组大鼠海马CA1区cleaved caspase-3免疫阳性细胞表达2VO术后4周,大鼠海马CA1区神经元可见有cleaved caspase-3的免疫阳性表达,阳性产物为棕色颗粒,主要定位于神经元的核的部分。2.HRW对VD大鼠海马CA1区cleaved caspase-3免疫阳性细胞表达的影响2VO术后4周,在大鼠海马CA1区cleaved caspase-3的IOD/area值各组间存在显著性差异（P<0.01）。与假手术组相比,模型组海马CA1区cleaved caspase-3免疫阳性细胞表达明显增高（P<0.01）。此外,与模型组相比,HRW组及多奈哌齐组海马CA1区cleaved caspase-3免疫阳性细胞IOD/area值均显著减少（P<0.01）。而HRW组IOD/area值高于多奈哌齐组（P<0.01）。3.HRW对VD大鼠海马Bcl-2和Bax蛋白表达的影响Bcl-2和Bax的表达以及Bcl-2/Bax比值在四组间均有显著性差异（P<0.01）。与假手术组比较,模型组Bcl-2表达显著降低（P<0.05）,Bax表达显著增加（P<0.01）,Bcl-2/Bax比值显著降低（P<0.01）。而给予HRW灌胃的大鼠海马Bcl-2表达增强（P<0.01）,Bax表达降低（P<0.01）,Bcl-2/Bax比值显著升高（P<0.01）。多奈哌齐组Bcl-2相对表达量与HRW组是相似的（P>0.05）,而Bax的表达却高于HRW组（P<0.05）,因此多奈哌齐组Bcl-2/Bax比值比HRW组明显降低（P<0.05）。小结:1.2VO术后4周大鼠海马神经元凋亡被激活,从而介导细胞程序性死亡。2.HRW可以减轻海马神经元凋亡来改善海马组织损伤。3.HRW抗氧化应激的作用,在抗神经元凋亡的机制中发挥了重要的作用。第四部分富氢水对血管性痴呆大鼠海马神经元细胞自噬的调控作用及对FoxO1介导的自噬通路的影响目的:通过观察2VO术后4周海马组织自噬相关蛋白表达水平的变化,进一步观察HRW对神经元自噬的调控作用,以及对FoxO1介导的自噬通路的影响,以探讨其神经保护作用的机制。方法:1.每组随机取3只大鼠,麻醉后,4%多聚甲醛灌注固定,常规石蜡包埋,冠状切片,采用免疫组化的方法,在光镜下观察各组大鼠海马组织CA1区微管相关蛋白1轻链3（Microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3）阳性细胞的表达。2.每组随机取6只大鼠,充分麻醉后,断头取材,分离海马,应用蛋白质免疫印记的方法检测大鼠海马组织中LC3B,B细胞淋巴瘤-2相互作用蛋白1（B-cell lymphoma-2 interacting protein 1,Beclin 1）,p62蛋白（Sequestosome-1,SQSTM1/p62）,叉头框蛋白O1（Forkhead box proteins 1,FoxO1）,自噬相关基因7（autophagy associated gene 7,Atg7）蛋白表达的水平。结果:1.四组大鼠海马CA1区LC3-Ⅱ免疫阳性细胞表达模型组大鼠海马CA1区有广泛的LC3免疫阳性细胞表达,阳性产物为棕色颗粒,主要定位于神经元的细胞质内;LC3-Ⅱ在各组间的IOD/area值有显著性差异（P<0.01）。2VO术后4周,模型组CA1区LC3-Ⅱ的IOD/area值相对于假手术组明显增加（P<0.01）。与模型组相比,HRW干预4周与多奈哌齐组干预4周后大鼠海马CA1区LC3-Ⅱ的IOD/area值均明显降低（P<0.01）。2.HRW对VD大鼠海马Beclin1,LC3,p62蛋白表达的影响与假手术组相比,模型组Beclin1的相对表达明显升高（P<0.01）,而HRW组和多奈哌齐组比模型组Beclin1的相对表达量明显降低（P<0.01;P<0.01）。此外,与假手术组相比,模型组2VO术后4周LC3-Ⅰ明显下降（P<0.01）,LC3-Ⅱ表达略有增加（P>0.05）,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著升高（P<0.01）。HRW组和多奈哌齐组与模型组相比均能显著降低LC3-Ⅱ/Ⅰ的增高（P<0.01;P<0.01）,但两组之间无显著性差异（P>0.05）。而模型组与假手术组相比,p62的相对表达水平明显降低（P<0.01）。与模型组比较,HRW组p62的相对表达水平明显增强（P<0.01）,多奈哌齐组同样也明显增高（P<0.01）,然而,HRW组和多奈哌齐组两组间差异却无统计学意义（P>0.05）。3.HRW减少了VD大鼠海马FoxO1和Atg7蛋白的表达与假手术组相比,模型组海马FoxO1和Atg7表达均显著增加（P<0.01;P<0.01）。经HRW干预后大鼠海马FoxO1和Atg7蛋白的表达水平明显低于模型组（P<0.01）及多奈哌齐组（P<0.01）。而多奈哌齐组与模型组之间两种蛋白的表达无显著性差异（P>0.05）。小结:1.2VO术后4周大鼠海马神经元细胞自噬激活。2.HRW可以下调2VO手术诱导的大鼠海马神经元自噬的激活。3.FoxO1可能是一个调节自噬的关键靶点,HRW至少部分地通过抑制FoxO1介导的自噬来达到神经保护作用。结论:1.2VO法制备形成CCH致VD大鼠模型,表现出明显的认知功能障碍,海马出现明显氧化应激反应,凋亡与自噬被同时激活,介导细胞程序性死亡,从而出现细胞损伤等病理形态学改变。这在一定程度上与临床VD的发病过程相似,效果可靠稳定,是VD的理想动物模型。2.HRW具有抗氧化应激的作用,能明显下调2VO手术诱导的海马神经元细胞凋亡与自噬,减少细胞程序性死亡,减轻VD大鼠海马组织病理学变化,改善VD大鼠的空间学习、记忆能力,其对认知改善效果甚至可以与多奈哌齐相媲美。3.FoxO1可能是一个调节自噬的关键靶点,它可以激活自噬,导致神经元细胞死亡;而HRW可能是通过下调2VO大鼠FoxO1依赖的自噬达到神经保护作用的。