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前言 CD-95是一种48-kD的跨膜糖蛋白,P75是一种75-kD的细胞表面糖蛋白。它们是NGF受体/TNF超家族的成员,是凋亡过程中重要的介子。在某些细胞的凋亡过程中有CD-95的存在,如活性T细胞或帕内特细胞,CD-95的生理作用主要体现在免疫细胞发育的调控和免疫细胞的细胞毒作用。P75在神经系统最初发育阶段起重要作用,它是低亲和力NGF受体。可以增加NGF高亲和力受体(TrKA)与NGF的结合率,调节络氨酸激酶活性,逆行性运输神经营养因子,促进神经鞘磷脂水解,能识别NGF家族所有成员并与之结合,诱导神经细胞凋亡,通过G蛋白的调节机制传导信息。某些基因如bcl-2的表达,可以部分拮抗CD95(Fas/Apo1)的凋亡作用。基于此,bcl-2a应用于许多尝试阻断CD95(Fas/Apo1)作用的试验中,人们试图用bcl-2a限制凋亡介导的细胞死亡。其它的抗凋亡方法包括CD95(Fas/Apo1)受体和P75的阻断或caspase的抑制。我们试验了脊髓损伤早期CD-95和P75的表达,判断二者在脊髓损伤早期的意义。 材料和方法 150只大鼠重约250-300克,雌雄不限,分成3个组,50只大鼠为空白对照组,50只为椎板切除对照组,另外50只为脊髓损伤对象。用Allen’s打击法进行动物实验,打击力量为50克.厘米。将要进行手术的大鼠背部备皮,用2%戊巴比妥钠25毫克/公斤腹腔注射麻醉大鼠,固定,消毒,腰背部正中切开皮肤,皮下组织,逐层分离 h-Tll椎板,完全咬除D,保持硬脊膜完整。固定骨窗上下位椎体脊突后,在骨窗上将一大小为 4 x 3 x lrnm的硬质塑料片平放于脊髓上作为打击垫片,用直径为2毫米重量10克的钢棒沿带有刻度的玻璃导管从5厘米高度垂直下落,造成脊髓损伤模型,打击后迅速移开钢棒。椎旁肌肉、皮下组织、皮肤用3-0可吸收线缝合。立刻就能观察到肢体的瘫痪,这一现象可以持续到整个实验过程。假手术组不用打击,只行椎板切除术。空白对照不做任何处理。术后正常喂养。假手术组及空白对照组没有瘫痪现象发生。在大鼠实验性脊髓损伤后 30分钟*小时J小时J小时*天上天上天J周在周/周取出脊髓固定。使用CD-95和P75的多克隆抗体进行免疫组化染色,JEM八(皿D)透射电镜进行电镜研究。从每一个实验动物的损伤区切片中镜下随机选取四个部分,其中灰质二个部分,白质2个部分。使用细胞记数,记录细胞在灰白质的总数(根据每个切片细胞核的数量人记录表达CD-95和P75阳性的细胞数和平均数。分析由两名不了解本实验内容的专业记数人员进行。在不同的时间点记录下CD-95和P75阳性细胞数。H者阳性细胞数占细胞总数差异用方差分析,一者在不同时间点灰白质之间的差异用 Student t1est。 结 果 在对照组,组织学研究表明是正常脊髓的特点,没有发现CD-95和P75免疫组织化学的阳性表达。脊髓损伤后30分钟可见严重的组织水肿,出血点,炎症细胞及核固缩、胞浆空泡等神经元变性的改变。免疫组化研究表明在脊髓后角的神经元上有阳性的表达,在出血点之间可见阳性的胶质细胞。在前角也有少量阳性神经元的表达,但在白质未见阳性表达。损伤后1小时,改变与30分钟相似。损伤后3小时,在白质中可见组织水肿及轴突的改 ·2·变,在灰质中均有强阳性的改变,在白质中有少量表达。形态学研究表明损伤后 30分钟至 3小时,CD-95免疫染色阳性的细胞数平均为78.3。1.\占灰质细胞总数的41。3%,占白质细胞总数的15。2%,这二者之间有统计学差异(P<o.05人P7 5阳性的细胞数平均为82。1.3,占灰质细胞总数的43。1.2%,占白质细胞总数的m。3防,这二者之间有统计学差异(P<O.05X电镜结果表明在此时间段没有凋亡现象发生。 损伤后6小时,灰质中可见出血点和组织坏死。HE染色揭示了神经元分布在坏死区周围。染色阳性细胞也见于小而圆的神经胶质细胞。在坏死细胞没有CD-95和pos阳性表达。免疫组织化学研究表明灰质中CD-95和pos阳性表达的神经元和胶质细胞明显增加。在白质中CD-95和P75阳性表达的胶质细胞也增加了,电镜结果表明细胞有凋亡现象发生。形态学研究表明损伤后6小时CD-95免疫染色阳性细胞数平均为132。8.1,占灰质细胞总数的 52。2.1%,占白质细胞总数的 43。1.6%,灰白质间无统计学意义河>0.05厂与其他时间点相比表达细胞数最多,有统计学意义瞩<O.o门。n5免疫染色阳性细胞数平均为15*。3、4,占灰质细胞总数的56。2%,占白质细胞总数的49。4.1%,灰白质间无统计学意义,但与其他时间点相比表达细胞数最多,有统计学意义u<0.01人 损伤后24-72小时,在白质和脊髓中央区清晰可见组织坏死,伴随坏死区有炎症细胞和小的出血点。CD-95和pos阳性表达细胞为圆形有致密黑核的胶质细胞,这些细胞随机分布在白质中。灰质中阳性细胞比白质少,可见呈阳性反应的较大的神经元。形态学研究表明CD-95免疫染色阳性的细胞数平均为85*1.5,占灰质细胞总数的门。2.3%,占