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构建pET28a(+)-vvhA融合基因原核表达载体,分离纯化融合蛋白VVC,并对其进行蛋白质复性和多克隆抗体制备.观察经有活性的融合蛋白VVC作用肝癌细胞后,肝癌细胞的TNF-α、HSP90和IL-10因子的表达情况,为进一步研究其生物物学作用奠定基础.
方法：1、pET28a(+)-vvhA融合基因原核表达载体的构建、表达与纯化利用PCR方法,以含vvhA基因的克隆质粒为模板,扩增融合基因vvhA并将其亚克隆入原核表达载体pET28a(+)中,构建成表达载体pET28a(+)-vvhA,限制性内切酶双酶切和测序鉴定质粒构建是否正确.将表达质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导其表达,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.将以包涵体形式表达的蛋白质,用洗涤液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ进行洗涤后,以Ni-NTA亲合层析法纯化VVC融合蛋白,SDS-PAGE和免疫印迹分析纯化产物.2、VVC融合蛋白的复性和多克隆抗体的制备将纯化目的蛋白分别用PBS液透析复性、柱上复性和加入不同浓度的盐酸胍、盐离子、助溶剂、氧化还原电势、沉淀剂、离子鳌合剂和不同浓度的缓冲液组成的16种不同复性液进行蛋白质复性对比.选出几种复性率较高的复性方法.利用复性纯化蛋白质作用新鲜兔红细胞悬液,观察细胞溶血情况来评价复性效果.用纯化目的蛋白免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,免疫印迹分析重组蛋白的免疫原性并用ELISA检测多克隆抗体的效价.3、体外实验对复性纯化蛋白的生物学活性进行初探将复性纯化蛋白作用于Hep2细胞,观察细胞的损伤情况,进一步印证复性效果.作用于人肝癌细胞株(SMMC7721),利用RT-PCR方法,检测TNF-α、HSP90、IL-10 mRNA动态变化,来初步评价VVC融合蛋白的生物学活性.
结果：
1、原核表达载体的构建、表达与纯化双酶切及测序结果表明原核表达载体pET28a(+)-vvhA与设计相符.工程菌BL21 DE3诱导表达后可在54Kda处产生特异性表达条带,能被抗His<,6>单克隆抗体特异性识别.表达蛋白质经三步洗涤后,再经Ni-NTA柱纯化,其纯度达96﹪以上.免疫印迹分析表明,纯化后的蛋白能被抗His<,6>单克隆抗体特异性识别.
2、VVC融合蛋白的复性和多克隆抗体的制备纯化的重组蛋白包涵体经16种不同复性液复性,均不同程度得到复性.其复性率最高可接近20﹪.同时重组蛋白包涵体利用PBS液进行复性得率却极低,但利用纯化柱进行柱上复性,其复性率却高达97﹪以上.免疫印迹分析证实,兔抗VVC融合蛋白多克隆抗体能与重组蛋白发牛特异性反应,ELISA检测其效价为1:25 600.
3、体外实验对复性纯化蛋白生物牛物学活性进行初探细胞增殖实验结果显示,兔抗VVC融合蛋白多克隆抗体能明显阻断VVC融合蛋白损伤细胞作用.TNF-α、HSP90和IL-10 mRNA结果显示,VVC融合蛋白能明显诱导肝癌细胞(SMMC7721)上调TNF-α、HSP90和下调IL-10分泌的能力,但具有时间和剂量依赖性.
结论：
本实验成功构建原核表达载体pET28a(十)-whA,分离纯化并成功复性有生物学活性的VVC融合蛋白.成功制备具有保护作用的兔抗VVC融合蛋白多克隆抗体.VVC融合蛋白能明显诱导肝癌细胞(SMMC7721)上调TNF-α、HSP90分泌和下调IL-10分泌的能力,为进一步研究其促炎症作用和致应激作用、单克隆抗体检测试剂盒的研发、疫苗的制备等奠定基础.