微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物，能够感染几乎所有的动物，是人类和多种经济动物的重要病原。家蚕微孢子虫（Nosemabombycis）是家蚕微粒子病的病原，因其能够经卵垂直传播，对蚕业生产危害极大，所以它一直被各养蚕国家和地区列为法定检疫对象。　　凝集素是许多病原的重要毒力因子，具有介导细胞间粘附、病原感染宿主、机体的天然免疫防御、宿主吞噬细胞清除入侵病原等作用。比较基因组分析发现，家蚕微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、蝗虫微孢子虫、肠道微孢子虫、柞蚕微孢子虫及东方蜜蜂微孢子虫等微孢子虫中均具有编码Ricin B-凝集素蛋白的基因，并且这些基因均为多拷贝，以串联重复形式存在。这类基因分布如此之广、拷贝数如此之多，它们在微孢子虫生命活动以及在侵染宿主过程中扮演着什么样的角色？它们以什么样的形式发挥作用？目前尚不清楚。　　本研究聚焦家蚕微孢子虫Ricin B-凝集素蛋白的基因Nbrbl3，首先利用生物信息学方法对其序列特征及亚细胞定位进行了预测，并对其进行了分子克隆和原核表达，利用获得的重组蛋白制备了多克隆抗体，通过间接免疫荧光技术分析了家蚕微孢子虫凝集素蛋白NbRBL3在家蚕微孢子虫成熟孢子中以及所侵染的宿主细胞内的亚细胞定位特征。通过对提取的家蚕微孢子虫孢壳蛋白、发芽液蛋白及感染家蚕微孢子虫细胞总蛋白进行免疫印迹分析，进一步探明了其在家蚕微孢子虫中的存在形式和定为特征。同时，利用杆状病毒表达系统在家蚕BmE细胞中高量表达NbRBL3，观察NbRBL3过量表达后对BmE细胞生长及增殖的影响，为下一步阐明NbRBL3在家蚕微孢子虫侵染宿主过程中的作用提供了参考。　　主要研究结果如下:　　1.NbRBL3的序列及转录特征分析　　NbRBL3由204个氨基酸构成，预测分子量为22.81 kDa，等电点为7.86。NbRBL3的N端1～14位氨基酸为其信号肽，56～172位氨基酸为Ricin B-lectin结构域。预测翻译后修饰发现第168位的天冬氨酸为N-糖基化位点，此外，预测还发现了16个磷酸化位点和5个C端微体靶向信号。亚细胞定位预测发现NbRBL3无跨膜结构域，无GPI-膜锚定位点，而具有偏向胞外分泌的特征，暗示NbRBL3可能为分泌性蛋白。二级结构预测结果显示，该蛋白具有一个α螺旋，且该螺旋位于其信号肽区域，13个β折叠及15个无规则卷曲，这与典型的蓖麻毒素B链具有非常相似的结构。　　设计Nbrbl3基因的特异性PCR扩增引物，以感染家蚕微孢子虫1～10天的家蚕中肠为材料，RT-PCR分析结果表明感染家蚕微孢子虫后1～10天的材料中均能检测到Nbrbl3基因的转录。这暗示着Nbrbl3可能在家蚕微孢子虫侵染家蚕的过程中发挥着重要功能作用。　　2.NbRBL3的原核表达、抗体制备及免疫印迹分析　　以家蚕微孢子虫Nbrbl3基因为模板设计PCR扩增引物，以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板进行PCR扩增和分子克隆，构建Nbrbl3的融合表达载体pET30-Nbrbl3。转化大肠杆菌Rosetta菌株，诱导表达后获得了该基因的重组蛋白，利用纯化的蛋白作为抗原免疫动物，制备了NbRBL3的多克隆抗体。玻璃珠震荡破碎法提取家蚕微孢子虫的总蛋白，利用制备的多克隆抗体为一抗进行Westernblotting分析，结果发现在25 kDa附近有一特异性条带，这表明在成熟家蚕微孢子虫中存在NbRBL3蛋白，但其较NbRBL3的理论分子量偏大，推测该蛋白可能存在翻译后修饰。　　3.NbRBL3的亚细胞定位　　为了检测家蚕微孢子虫成熟孢子内NbRBL3的表达分布特征，以纯化的成熟孢子进行间接免疫荧光分析(IFA)，结果表明:灭菌水处理的孢子中没有荧光信号，2％ SDS处理的孢子外周出现弥散荧光信号，而且经过1％ Triton处理的孢子外周信号较强，经28℃、0.1M K2CO3处理的孢子中荧光信号变弱，经37℃、0.1MK2CO3处理6h后获得的孢壳中没有发现荧光信号。这表明NbRBL3蛋白可能位于成熟孢子的孢原质中，发芽后被分泌出孢原质。　　以纯化的成熟家蚕微孢子虫的孢壳为材料，提取孢壳蛋白，利用NbRBL3的抗体进行Western blotting分析，结果并未发现有杂交信号，而经0.1M K2CO3发芽处理获得的发芽液蛋白中，Western blotting检测发现在25 kDa附近有一特异性条带。这进一步表明NbRBL3可能存在于成熟孢子的孢原质内，孢子发芽后可能被分泌到孢原质外。　　4.感染的家蚕BmE及血细胞中NbRBL3的检测　　基于家蚕微孢子虫成熟孢子中NbRBL3的定位信息，我们推测该蛋白为分泌蛋白。本研究以感染家蚕微孢子虫的BmE细胞及血细胞为材料，利用间接免疫荧光技术，以NbRBL3的鼠抗及兔抗对NbRBL3在感染细胞中的表达进行共定位。激光共聚焦结果显示，荧光信号除了分布于家蚕微孢子虫成熟孢子内部以外，还存在于家蚕细胞的细胞膜及核膜上。这一结果表明NbRBL3为外泌性蛋白，能够被分泌到宿主细胞的原生质体膜和核膜上从而发挥其生物学功能。　　收集感染家蚕微孢子虫的家蚕BmE细胞，裂解细胞后收集总蛋白上清液及沉淀。免疫印迹分析显示，在上清液中存在NbRBL3蛋白，这再次印证了NbRBL3作为一种分泌型蛋白在孢子侵染宿主细胞过程中发挥作用的结论。　　5.NbRBL3的功能初探　　本研究利用杆状病毒表达系统，将Nbrbl3基因克隆到斜纹银翅夜蛾核型多角体病毒转移载体pFastBacHTB上，将pFastBacHTB-Nbrbl3转化到DH10Bac感受态细胞，与Bacmid发生同源重组，最终获得重组转座子Bacmid-Nbrbl3;将构建的杆状病毒粒子感染家蚕BmE细胞，利用该系统在家蚕BmE细胞中获得可溶性分泌型重组蛋白NbRBL3，观察发现该蛋白高量表达能够导致家蚕BmE细胞的凝集。但这种凝集意味着什么，与NbRBL3发挥的功能作用有什么样的联系，还需要进一步研究。