研究目的:以TCDD为代表的二噁英是典型的环境内分泌干扰物,二噁英可透过胎盘屏障,由胎盘及乳汁进入胚胎及婴儿体内,引发宫内及哺乳期二噁英暴露。世界卫生组织2012年的文章指出,环境内分泌干扰物可对儿童早期发育产生不良影响,不仅包括引起隐睾、尿道下裂、青春期提前,还可影响儿童神经系统发育,对智力、行为和情感造成不良影响。健康与疾病的发育起源理论(Developmental Origins of Health and Disease,DOHaD)指出,宫内敏感时期及出生早期暴露于干扰,会改变器官功能与结构编码(重新编码),进而引发暴露个体以后生命过程中发生行为学习障碍。本实验希望就宫内暴露于环境内分泌干扰物TCDD对子代神经系统发育及记忆学习能力的影响进行探究,同时对造成这些影响的机制进行一定的探索。研究内容和方法:本研究主要探讨TCDD宫内暴露对F1代雄鼠神经系统发育、神经行为及空间记忆学习能力的影响,主要内容总结如下。1.TCDD宫内暴露实验动物模型的建立:Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)适应性饲养一周后合笼交配,阴栓出现即认为交配成功,并记为孕期第0天(GD0)。将孕鼠随机分为两个TCDD剂量组(剂量分别为200,800ng/kg bw)和溶剂对照组(玉米油+DMSO)。于孕期第8-14天(GD8-14)每日定时灌胃染毒。雄性子鼠出生后21天(PND21天)离乳分笼,并继续饲养,直至雄鼠达到成年期(PND90)。2.F1代雄鼠出生早期神经行为发育评价:F1代雄性仔鼠于PND5天接受早期神经行为发育测试,同时观察并记录其开眼时间。早期神经行为学测试包括:平面翻正实验、悬崖回避实验和负趋地性实验。此外在PND10-PND15天期间,持续对雄鼠开眼情况进行观察并记录每只雄鼠的开眼时间,直至所有雄鼠均开眼为止。3.成年F1代雄鼠Morris水迷宫实验:F1代雄鼠继续饲养至出生后90天(PND90)时,进行Morris水迷宫(Morris Water Maze)测试,以评价宫内TCDD暴露对子代雄鼠成年时空间记忆及学习能力的影响。根据Nature推荐的实验流程,水迷宫实验为期6天,1-5天为定位巡航实验,第6天为空间探索实验。定位巡航实验中,受试大鼠每天接受4次训练,记录各实验大鼠逃避潜伏期、累积路程、各象限停留耗时、各象限路程等指标。第6天记录受试动物穿越原平台次数、目标象限耗时及路程。同时试验还对大鼠游泳策略进行评价分析。4.f1代成年雄鼠血清激素水平检测:本实验采用直接化学发光法测定雄性大鼠血清中睾酮和雌二醇的水平,采用advia-centaur全自动化学发光免疫分析检测仪(advia-centaurxp,simens,germany)及其配套试剂盒进行检验。雄性大鼠血清中甲状腺激素五项的水平也使用该方法进行检测,甲状腺五项包括ft3、ft4、tsh、tt3和tt4。5.f1代雄鼠海马组织神经系统免疫组化:将固定好的雄鼠海马组织制作成石蜡切片,采用神经元尼氏染色法,对海马神经元进行染色,并于光镜下计数海马组织神经元数量。采用胶质细胞酸性蛋白免疫组化法对海马星形胶质细胞活性情况进行分析。研究结果:1.宫内tcdd暴露造成f1代雄鼠早期神经行为发育改变,800ng/kgbw剂量组雄鼠pnd5表现出更高的活动力,同时开眼时间明显提前。2.宫内tcdd暴露造成f1代雄鼠成年空间记忆与学习能力受损。morris水迷宫中,两个tcdd剂量组雄鼠表现均较对照组差,特别是800ng/kgbw组雄鼠在游泳速度、逃离潜伏期、穿越原平台次数上均不及对照组。这与800nk/kgbw剂量组雄鼠出生早期时活动力由于对照组形成有趣对比。但对各组大鼠游泳策略分析并没有发现显著差异。3.宫内tcdd暴露造成f1代雄鼠血清激素水平改变。研究发现,两个剂量组雄鼠血清雌二醇水平均低于对照组,并且800nk/kgbw组与对照组的差别有统计学意义。甲状腺激素水平没有明显变化。4.宫内tcdd暴露造成f1代雄鼠海马神经系统免疫组化染色改变。研究发现,宫内tcdd暴露并未对海马ca1区神经元数量及形态造成显著影响,但染毒后出现星形胶质细胞活性明显下降现象。研究结论:通过以上实验,我们发现,宫内暴露于tcdd的f1代雄性大鼠神经行为发育受到影响,表现为早期神经行为发育提前,而成年后空间记忆与学习能力受到损伤。进一步研究发现,空间记忆与学习能力受损可能与海马组织星形胶质细胞受损相关。对成年F1代雄鼠体内性激素水平测定显示,雌二醇水平下降,这提示海马星形胶质细胞受损可能与雌二醇水平较低,无法对中枢神经系统提供应有的保护。以上实验结果提示,人类母亲暴露TCDD等环境内分泌干扰物时,不仅可能对母体产生不良影响,同时可造成后代神经行为发育异常,特别是对后代的智力、学习记忆能力、社会情感及认知,产生不可逆转的影响。针对目前环境内分泌干扰物全球影响范围大,污染情况复杂的情况,更应加强对其的治理,尽可能减小对人体的不良影响。