14-3-3蛋白家族是一组高度保守，广泛分布于真核生物中的酸性蛋白质。研究表明，它们通过与一些蛋白质相互作用参与调控了诸多重要的细胞进程。但是，关于这些蛋白如何参与有丝分裂调控尚不明确。Polo样蛋白激酶1（Polo-likekinase1，Plk1）是一类高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶。Plk1在细胞周期的有丝分裂过程中起重要的作用，例如参与中心体的成熟，染色体的分离，胞质分裂以及DNA的损伤应答。本实验中，我们通过酵母双杂交等方法证实了14-3-3ζ异构体在细胞有丝分裂期与Plk1的相互作用，且两者共定位于胞质分裂中体部位。同时，Plk1330/597位丝氨酸磷酸化增强其与14-3-3ζ的相互作用，两者通过形成复合体协同保证胞质分裂的顺利完成。综上所述，我们认为14-3-3蛋白参与了细胞有丝分裂的调控，其机制是通过与Plk1协同保证正常的胞质分裂。目的：酵母双杂交筛选14-3-3ζ相互作用蛋白，证明14-3-3ζ与Plk1之间的相互作用，并探究两者相互作用对胞质分裂的影响。方法：细胞免疫荧光实验观察14-3-3ζ与Plk1的亚细胞定位；酵母双杂交、细胞免疫共沉淀以及GST-pull down实验证明14-3-3ζ与Plk1蛋白之间存在相互作用；构建Plk1磷酸化突变体观察Plk1330/597位丝氨酸磷酸化对两者相互作用的影响；基因敲除14-3-3ζ以及过表达Plk1磷酸化突变体探究14-3-3ζ与Plk1蛋白相互作用对胞质分裂的影响。结果：1.14-3-3ζ在有丝分裂中期定位于纺锤体，在胞质分裂期定位于中体部位取细胞同步化处理后贴壁的生长状态良好的Hela细胞，经多聚甲醛固定，Triton-X-100打孔以及BSA封闭后，分别加入一定稀释浓度的14-3-3蛋白各个异构体的单克隆抗体进行免疫荧光染色，荧光显微镜下观察并拍照，结果显示14-3-3ζ在有丝分裂中期定位于纺锤体，在胞质分裂期定位于中体部位。2.14-3-3ζ与Plk1蛋白相互作用2.1酵母双杂交为了更充分地阐明14-3-3ζ蛋白在有丝分裂进程中的功能，我们以14-3-3ζ作为诱饵蛋白，运用酵母双杂交系统筛选14-3-3ζ相互作用蛋白，结果显示其中一个相互作用蛋白是Polo样激酶1（Polo-like kinase1，Plk1）。2.2酵母共转将筛选出的Plk1构建到PGADT7载体，然后与14-3-3ζ的酵母表达载体共转至酵母AH109菌株，将共转细胞涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上筛选，进一步在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培养基上验证，结果出现蓝色阳性克隆。2.3细胞免疫荧光双标将细胞周期同步化处理的黏附在盖玻片上的HeLa细胞固定和抽提以后，共染兔抗14-3-3ζ单克隆抗体（绿色）、鼠抗Plk1单克隆抗体（红色）、DAPI（蓝色）、重叠图像表明14-3-3ζ与Plk1共定位于胞质分裂期的中体部位。2.4细胞免疫共沉淀2.4.1外源性免疫共沉淀将外源性的Plk1-Flag和14-3-3ζ-GFP、14-3-3ζ-K49E-GFP（14-3-3ζ蛋白突变体，阴性对照）以及GFP质粒分别共转染至293T细胞，Flag抗体从293T细胞裂解液中免疫沉淀可溶性的Plk1。免疫沉淀物经SDS-PAGE电泳，转移到硝酸纤维膜上，分别用Flag及GFP抗血清杂交。结果显示，只有14-3-3ζ-GFP和Plk1-Flag共转染细胞时，Plk1才可以与14-3-3ζ沉淀，Plk1-Flag和14-3-3ζ-K49E-GFP以及GFP共转染细胞时，不能共同沉淀。表明Plk1与14-3-3ζ在细胞中存在相互作用。2.4.1内源性免疫共沉淀通过14-3-3ζ抗体从HeLa细胞分裂间期以及有丝分裂期的裂解液中免疫沉降可溶性的Plk1。免疫沉降物经SDS-PAGE，转移到PVDF膜上，分别用14-3-3ζ和Plk1抗体杂交。用14-3-3ζ抗体杂交时，在相对分子质量（Mr）约30000处得到一蛋白条带，证实是14-3-3ζ；用Plk1抗体杂交后，证实Mr66000的条带为Plk1，在使用蛋白A/G偶联IgG的对照实验中，没有检测到14-3-3ζ与Plk1。同时，我们可以发现14-3-3ζ与Plk1在有丝分裂期相对于分裂间期有更强的相互作用。2.5GST-pull down为了观察14-3-3ζ是否与Plk1存在直接的相互作用，我们利用纯化后的带GST标签的14-3-3ζ蛋白与纯化后带His标签的Plk1蛋白进行GST-pull down实验，结果发现14-3-3ζ不能与Plk1直接相互作用。3. Plk1330/597位丝氨酸磷酸化增强其与14-3-3ζ蛋白相互作用3.1Plk1与14-3-3ζ的相互作用具有磷酸化依耐性瞬时转染Plk1-flag质粒至293T细胞中，接着在细胞裂解液中加入一定量的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂冈田酸OA或λ-磷酸酶，然后加入GST蛋白或14-3-3ζ的GST融合蛋白孵育，最后用抗Flag单克隆抗体进行Western blot检测。结果显示，在加入冈田酸处理后，Plk1呈现与14-3-3ζ较强的相互作用。3.2Plk1330/597位丝氨酸磷酸化增强其与14-3-3ζ蛋白的相互作用构建Plk1野生型、模拟磷酸化突变体Plk1^S330/597D以及非磷酸化突变体Plk1S330/597A的GFP融合蛋白，分别将上述三种质粒瞬时转染293T细胞，细胞裂解液分别与GST蛋白以及14-3-3ζ的GST融合蛋白低温旋转孵育，样品收集后用抗GFP单克隆抗体进行Western blot检测。结果表明，模拟磷酸化突变体Plk1^S330/597D与14-3-3ζ存在较强的相互作用，而非磷酸化突变体Plk1S330/597A与14-3-3ζ相互作用较弱。同时，构建Plk1野生型以及模拟磷酸化突变体Plk1^S330/597D的HIS融合蛋白，用于体外的GST-pull down实验，分别与14-3-3ζ的GST融合蛋白低温孵育，同时用GST蛋白作为阴性对照。收集样品进行考马斯亮蓝染色以及Western blot检测。结果证实，模拟磷酸化突变体Plk1^S330/597D在体外与14-3-3ζ存在较强的相互作用，而野生型Plk1与14-3-3ζ相互作用强度很微弱。3.3Plk1330/597位丝氨酸磷酸化对其与14-3-3ζ蛋白相互作用的增强发生在有丝分裂期Hela细胞共转染14-3-3ζ-flag和野生型Plk1、模拟磷酸化突变体Plk1^S330/597D以及非磷酸化突变体Plk1S330/597A的GFP融合蛋白，用Flag抗体从HeLa细胞有丝分裂期的裂解液中免疫沉降可溶性的14-3-3ζ及其结合蛋白，免疫沉降物经SDS-PAGE，转移到PVDF膜上，分别用Flag和GFP抗体杂交。结果显示，模拟磷酸化突变体Plk1^S330/597D与14-3-3ζ蛋白相互作用较强，而野生型Plk1和非磷酸化突变体Plk1S330/597A与14-3-3ζ蛋白相互作用强度较弱。4. Plk1330/597位丝氨酸磷酸化与14-3-3ζ协同保证胞质分裂的顺利完成4.1Plk1蛋白对14-3-3ζ在纺锤体和中体的定位是必须的Hela细胞瞬时转染14-3-3ζ或Plk1的si-RNA，细胞周期同步化处理后，将黏附在盖玻片上的HeLa细胞固定和抽提，共染兔抗14-3-3ζ单克隆抗体（绿色）、鼠抗Plk1单克隆抗体（红色）、DAPI（蓝色）。重叠图像表明：敲除14-3-3ζ后没有观察到对Plk1定位的影响，但是当Plk1蛋白表达缺失时，未见正常情况下14-3-3ζ在纺锤体和中体的定位，因此Plk1对14-3-3ζ在有丝分裂期的定位是必须的。4.2基因敲除14-3-3ζ影响正常的胞质分裂进程转染14-3-3ζ的siRNA至Hela细胞中，从而抑制内源性14-3-3ζ蛋白的表达，结果导致大量的Hela细胞处于中体形成阶段，同时多核细胞异常增多，呈现非正常的有丝分裂进程。通过细胞计数观察转染14-3-3ζ-siRNA后不同时间细胞形态学变化，结果显示：转染72hrs后多核细胞比例仍然呈上升趋势，而处于中体形成阶段的细胞比例呈下降趋势。4.3异常表达Plk1影响正常的胞质分裂进程分别转染野生型Plk1、模拟磷酸化突变体Plk1^S330/597D以及非磷酸化突变体Plk1S330/597A的GFP融合蛋白至Hela细胞，免疫荧光染色观察转染后细胞形态学变化。结果显示Plk1330/597位丝氨酸磷酸化对于正常胞质分裂具有必要性。结论：14-3-3ζ协同Plk1激酶保证胞质分裂的顺利进行。