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本试验通过裂解小鼠组织并提取基因组DNA而研究了NaCl在小鼠组织裂解中的作用、蛋白酶K与EDTA在组织裂解中的相互作用关系、SDS在小鼠组织裂解中的作用及其它几种因素对小鼠组织裂解的影响,进而探讨了基因组DNA提取时小鼠组织裂解的机理。本试验克隆了长1750bp小鼠WAP基因3’侧翼区序列,并对其进行了序列测定与分析。具体结果如下:
1.通过在同一种裂解缓冲液中添加不同浓度的NaCl而裂解同一种小鼠组织结果表明,NaCl在小鼠组织裂解中起重要作用,NaCI浓度低的裂解液不能较好的裂解组织,0.1mo1.L-1的NaCl可较好的满足小鼠组织裂解的需要而被大多数裂解液所采用。
2.比较几种裂解液中蛋白酶K的浓度与EDTA的浓度及其裂解效果表明,在组织裂解中EDTA对蛋白酶K的活性有影响,裂解液中高浓度的EDTA需耗费较多的蛋白酶K。
3.在一定DNA提取纯化条件下,从EDTA的浓度与所提取基因组DNA的质量的关系可以看出,SDS具有较高的钝化核酸酶的能力,可较好的保护DNA,裂解液中EDTA的浓度不须太高。
4.裂解温度对组织裂解效果有影响。可使SDS和蛋白酶K都处于较好工作状态的温度才能使组织较好的裂解,过高的裂解温度有害无益,常用的裂解温度为50-55℃。
5.小鼠组织细胞裂解前的剪切和挤压等预处理对裂解并无太大帮助,有时反而起到阻碍作用。
6.思考以上结果可以看出,在裂解小块动物组织时裂解成分可能是通过细胞间呈凝胶状态的基质扩散而接触细胞并发挥作用的。NaCl在细胞间基质凝胶的形成和维持中可能起重要作用。
7.试验比较了几种常用的DNA提取纯化方法,在小鼠基因组DNA提取纯化时,玻璃棒缠绕法和硅基质离心柱法比较实用。
8.本试验克隆了长1750bp的小鼠WAP基因3’侧翼区序列,序列测定与分析结果表明其与GenBank中收录的相应序列的同源性为97%,可以作为调控序列以构建乳腺特异表达载体。