捻转血矛线虫属毛圆科血矛属线虫,是山羊等反刍动物的主要胃肠道寄生虫之一,患病动物通常表现为贫血、消瘦甚至死亡,造成巨大经济损失。目前的主要防治方法是使用化学药物驱虫,但随着抗药性虫株的的出现,化学药品治疗正受到严重的挑战。人们正在努力寻求新的防控策略,其中免疫预防用分子疫苗的研发尤其受到重视,但迄今没有一种高保护性的分子疫苗能够推广应用于现场。以前的研究发现,应用γ射线和紫外线照射致弱的捻转血矛线虫和蛇形毛圆线虫幼虫免疫家畜都获得了较高的保护性效果,而正常幼虫感染则不能诱导较高的抗再感染的效果,提示辐照致弱线虫幼虫来源的细胞或分子具有较好的免疫原性特征,而正常幼虫的则具有耐受原性特征。另外,近年来在抗肿瘤免疫研究中也发现,用某些药物和光辐照疗法处理一些肿瘤细胞后免疫动物,也能够诱导较高水平的抗肿瘤效果,其机制可能是经处理的肿瘤细胞启动了免疫原性细胞死亡程序,触发了特异的信号和效应分子,与宿主先天免疫细胞作用,最终诱导了抗肿瘤的免疫应答。因此,我们推测:辐照致弱线虫幼虫细胞有可能出现免疫原性细胞死亡(坏死性凋亡),能够刺激宿主的保护性免疫应答,而正常线虫幼虫细胞则可能以凋亡为主,主要诱导宿主的免疫耐受。但这一假说是否成立,仍有待我们实验确定。为此,本研究首先对体外培养不同时期的辐照致弱和正常捻转血矛线虫幼虫的生长变化特征及凋亡和坏死进行了比较观察;然后对它们的基因表达谱变化情况进行了分析,旨在为进一步阐明辐照幼虫免疫原性细胞死亡的机制提供依据。首先,我们培养收集捻转血矛线虫三期幼虫,采用紫外辐照方法致弱捻转血矛线虫幼虫。体外培养,光学显微镜观察0d(辐照后2 h),2d,5d,10d,13d和16d不同时期的幼虫的发育情况,设正常幼虫为对照组。结果发现:随着体外培养时间的延长,正常组幼虫形态呈现正常发育特征,而辐照组中,0d时,辐照致弱组幼虫与正常组幼虫形态和活力基本无差异。2d时,两组幼虫都有发生脱鞘的现象,但辐照致弱组脱鞘的比例大于正常组的;两组食道和体表无显著差异,且活力都较好。5d时,两组幼虫均有部分L3发育至L4,辐照致弱组幼虫发育至L4的比例低于正常组幼虫,且辐照组未脱鞘的L3幼虫活力明显降低,活动幅度减少,肠细胞死亡,细胞形态消失。10d时,正常组幼虫约有80%发育至四期,辐照组幼虫却只有20%左右发育率且虫体形态开始发生变化,有的幼虫出现萎缩现象,活力明显减小。13d时,辐照组幼虫体表凹凸不平,肠道颜色加深,虫体皱缩;正常组幼虫活力有所下降,虫体出现萎缩现象。16d时,辐照组幼虫活力消失,体表紊乱,体内有空泡;而大部分正常组幼虫仍然具有活力。说明辐照后的幼虫呈现出明显的类似坏死性凋亡的形态学变化,而正常组幼虫呈现凋亡的形态特征。其次,为了进一步确定辐照捻转血矛线虫幼虫细胞是否出现了坏死性凋亡样现象,培养收集捻转血矛线虫三期幼虫,采用紫外辐照方法致弱捻转血矛线虫幼虫,体外培养至0d,2d,5d,10d,13d和16d,运用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察幼虫超微结构变化。SEM结果显示:与正常组幼虫比较,辐照组幼虫更早出现体表萎缩,后期体表呈现凹凸不平和扭曲的现象,且萎缩扭曲程度更严重。TEM结果显示,早期两组幼虫未呈现明显差异变化,10-16d正常组幼虫呈现出逐渐凋亡的表型变化,而辐照组幼虫呈现出更明显的坏死性凋亡样表型变化。说明辐照和正常幼虫的确具有上述不同的死亡方式。最后,运用RNA-seq测序技术,对正常组和辐照组捻转血矛线虫幼虫体外培养不同时期的基因表达谱变化进行了分析。发现在培养早期,一些与细胞早期凋亡和生长相关的基因或信号途径高度富集;而在培养晚期,与细胞坏死等相关的基因或途径得到富集。进一步鉴定了3个与免疫原性细胞凋亡相关的基因HSP70、HMG和CRT,发现它们在早期辐照组中的表达量高于正常组的。这些结果为深入探索辐照致弱幼虫免疫原性细胞死亡的分子机制提供了基础。总之,本研究发现辐照捻转血矛线虫幼虫呈现出与坏死性凋亡相关的表型变化,初步探索了其分子机制,鉴定了3个与免疫原性细胞凋亡相关的基因。为进一步阐明辐照幼虫免疫原性细胞死亡的机制奠定了基础。