随着生物学和医学的不断发展,单克隆抗体技术在免疫治疗、免疫分析、免疫纯化等领域得到广泛应用。在单克隆抗体的制备和筛选中,最重要的工作之一是对不同细胞株分泌的抗体的亲和力这一关键指标进行评价。因此,研究快速、简单、准确的抗体亲和力测定新方法对于单克隆抗体的应用具有非常重要的指导意义。微透析(microdialysis,MD)是一种微量采样技术,具有可原位、活体采样和在线、实时检测等特点。其工作原理是外部介质中的小分子物质在浓度梯度差的作用下,被动扩散通过透析膜到达探针腔中,而蛋白质和细胞等大分子物质则被阻挡在外,从而实现对小分子物质的采样。流动注射化学发光(flow injectionchemiluminescence,FI-CL)法是将微量、高速和自动化的进样技术与高灵敏度的化学发光检测技术结合而提出的一种痕量分析方法。其原理是待测物浓度与化学发光强度在一定范围内呈线性定量关系,利用仪器对反应体系化学发光强度的测定,来确定待测物含量。本文将MD应用于小分子半抗原采样,结合高灵敏度的FI-CL分析,以β-激动剂这一不宜直接标记的小分子半抗原为例,在均相条件下研究这些小分子半抗原与抗体间的亲和力,建立了MD-FI-CL的在线联用方法,用于测定抗体亲和力,为小分子半抗原的抗体性能评价提供了一个新型的分析方法平台:(1)在线微透析采样结合化学发光法测定特布他林单克隆抗体亲和力本研究利用在线MD采样方法,结合高灵敏度的FI-CL分析法,在均相体系中研究特布他林与其单克隆抗体之间的亲和力,提出了用于测定单克隆抗体亲和力的免标记型新方法。MD探针可以将结合型特布他林及游离型抗体阻挡在半透膜外,从而实现对小分子半抗原(特布他林)的取样,随后将含有游离型半抗原的透析液注入FI-CL系统。碱性条件下,特布他林对鲁米诺-铁氰化钾系统的化学发光有较强的增敏作用,因此,通过测定化学发光信号,可以实现透析液中特布他林的检测。并通过MD探针的回收率校正,计算出免疫反应体系中游离半抗原的浓度,最后通过Scatchard和Klotz公式,计算得到特布他林单克隆抗体的亲和力。两种计算方法所得结果均为4.9×106 M-1,说明特布他林单克隆抗体是中等亲和力的抗体,该结果与硫氰酸盐洗脱法所得结果一致。该方法操作简便、成本低、分析时间短,为单克隆抗体亲和力的测定提供了新的途径。(2)在线微透析采样结合化学发光法测定莱克多巴胺单克隆抗体亲和力本研究基于在线MD和FI-CL的联用技术构建了一种测定抗体亲和力的免标记型新方法,用于直接测定莱克多巴胺与其单克隆抗体间的亲和力常数。MD探针可以将结合型莱克多巴胺及游离型抗体阻挡在半透膜外,从而实现对免疫反应体系中游离型莱克多巴胺的取样,随后将含有游离型半抗原的透析液注入FI-CL系统。碱性条件下,莱克多巴胺对鲁米诺-高锰酸钾系统的化学发光有较强的增敏作用,因此,通过测定化学发光信号,可以实现对透析液中莱克多巴胺的检测。并通过MD探针的回收率校正,计算出免疫反应体系中游离半抗原的浓度,最后通过Scatchard和Klotz分析,计算得到莱克多巴胺单克隆抗体的亲和力。两种分析方法所得结果均为1.0×106 M-1,说明莱克多巴胺单克隆抗体是中等亲和力的抗体,该结果与硫氰酸盐洗脱法所得结果一致。因此,我们认为该方法用于抗体亲和力的测定是简单、可行的,可以广泛地应用于免疫化学领域。