论文部分内容阅读
目的:环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类无5’末端帽子和3’末端poly（A）尾巴结构、以共价键形成的环形内源非编码RNA。与线性RNA相比,不受RNA外切酶、脱腺苷、脱帽的影响,表达更加稳定。已有研究证明,circRNA存在于各种细胞当中,具有组织细胞和发育阶段特异性,参与了细胞增殖、凋亡、衰老等生物学过程。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）异常增殖和凋亡,是动脉粥样硬化等血管重塑性疾病形成与发展的重要病理学事件。CircRNA是否参与VSMCs增殖调控,分子机制如何?迄今尚不清楚。本研究中我们采用基因芯片技术,筛查分析人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells,HASMCs）增殖相关circRNA和mRNA表达谱,从circRNA作为micro RNA海绵、编码蛋白质等角度进行生物信息学分析,为后续circRNA的分子机制探究提供线索;然后,对候选circRNA进行敲降或过表达干预,探讨其对HASMCs增殖、凋亡的影响。以期为VSMC增殖性疾病的发病机制研究提供新思路,为发掘新型治疗靶点提供依据。方法:1基因芯片分析circRNA和mRNA表达谱采用基因芯片对PDGF诱导的增殖型和血清饥饿诱导的静止型HASMCs中的circRNA和mRNA表达谱进行分析,差异基因的筛选标准为fold change≥2或≤-2,P<0.05。2差异表达circRNA的qRT-PCR验证选取13种差异表达的circRNA,分别在环化位点两侧设计反向（divergent）引物,通过实时定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）技术,检测它们在增殖型和静止型HASMCs中的表达水平,通过2-ΔΔCt法计算差异倍数。3差异circRNA和mRNA的生物信息学分析对差异表达的mRNA和差异表达的circRNA宿主基因进行GO（Gene ontology）分析,GO包括分子功能、生物过程以及细胞组成等,同时进行pathway分析。结合现有的AGO2沉淀的RNA测序数据[1],筛选与AGO2结合,可能作为micro RNA海绵的差异表达circRNA。选取其中5种circRNA,通过生物信息学软件分别预测它们可能结合的micro RNA,然后分析这些micro RNA可能调控的差异mRNA,构建circRNA-micro RNA-mRNA互作网络。对差异表达的circRNA与其对应的线性mRNA的表达相关性进行分析。并通过circRNADb平台,分析筛选可能编码蛋白质的circRNA。4 circRNA对HASMCs增殖、凋亡的影响基于circRNA的环化位点设计合成特异的si RNA,转染HASMCs,通过q RT-PCR验证敲降效率,通过Western Blot检测相关蛋白的表达水平,通过流式细胞术检测细胞周期、细胞磷脂酰丝氨酸外翻情况,分析细胞增殖、凋亡状态。5 circRNA表达载体构建根据hascirc0001304以及hascirc0040705的序列设计引物,引物5’端引入Eco R I酶切位点,3’端引入Xba I酶切位点。提取RNA,经反转录后进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳后对目的条带进行胶回收,经Eco R I/Xba I双酶切后回收片段,插入pc DNA31（+）CircRNA Mini Vector真核基因表达载体中,转化后挑取单菌落,进行菌落PCR和双酶切鉴定,最后进行测序分析。结果:1基因芯片结果显示,与静止型HASMCs相比,增殖型HASMCs中有66种circRNA表达水平出现上调,68种circRNA表达水平降低;有3019种mRNA表达上调,701种mRNA表达下调。2通过qRT-PCR技术,检测13种circRNA在增殖型HASMCs和静止型HASMCs的表达水平。结果显示,12种circRNA的表达差异与基因芯片的结果一致。3 GO分析显示差异表达的circRNA相关的mRNA可以参与到蛋白运输（protein transport）等细胞活动中;Pathway分析发现最有意义的腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine Monophosphate activated protein kinase,AMPK）和micro RNA两个通路。而对于差异表达的mRNA,GO分析可知其参与到细胞周期阻滞负向调节（negative regulation of cell cycle arrest）等生物过程,而pathway分析可知涉及的通路包括促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）等信息传递和增殖相关通路。通过分析发现,78种差异circRNA能够与AGO2结合,可能作为micro RNA海绵发挥作用。选取其中的5种circRNA:hsacirc0000069、hsacirc0002579、hsacirc0004872、hsacirc0006371、hsacirc0040705,构建circRNA-micro RNA-mRNA互作网络,结果显示,它们与通过micro RNA的介导C2orf44,IGF2BP1,HMGA2,KLF7等254种差异基因具有共表达相关性,为后续探究circRNA的调控靶点提供了重要线索。对差异表达的circRNA与其对应的线性mRNA的表达相关性进行分析,发现circRNA与其对应的线性mRNA的表达没有相关性。通过circRNADb平台,筛选得到24种circRNA含有核糖体进入序列和开放阅读框,提示它们可能编码蛋白质。4采用siRNA敲降HASMCs中的hascirc0040705和hascirc0001304,Western Blot分析表明,细胞增殖标志基因PCNA水平显著降低,VSMC表型分化标志基因SM22a、凋亡相关蛋白Bax的水平显著升高。流式细胞术分析表明,敲降hascirc0040705或hascirc0001304均能促进HASMCs凋亡。此外,敲降hascirc0001304能够明显抑制QKI蛋白的表达。5经酶切鉴定、测序分析证明,成功构建hascirc0001304和hascirc0040705的真核表达载体,为下一步功能与机制研究奠定了基础。结论:1在HASMCs增殖过程中,许多circRNA表达水平发生改变。通过生物信息学分析表明,circRNA可能通过作为micro RNA海绵、编码蛋白质等途径发挥调控功能;2 Hascirc0040705和hascirc0001304具有促进HASMCs增殖、抑制细胞凋亡的功能,是潜在的VSMC增殖性疾病的干预靶点。