目 的:1.基于系统评价和meta分析评价中药复方治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期的有效性及安全性。2.采用数据挖掘技术探索现代医家对于慢性阻塞性肺疾病的认识及用药规律。3.基于网络药理学分析中药复方七味都气丸化裁方治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期可能的作用机制和潜在靶点。4.设计动物实验基于MKK3/6-P38 MAPK信号通路探索七味都气丸化裁方干预慢性阻塞性肺疾病稳定期疗效及机制。材料与方法:1中药复方治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期有效性及安全性系统评价与meta分析全面检索6个电子数据库中关于中药复方联合西医常规治疗干预慢性阻塞性肺疾病的随机对照实验。对检索到的文献由两名独立的研究者分别进行筛选文献、提取数据、评价文献质量及评估偏倚风险,若有分歧则协商解决,否则由第三名研究者进行裁决。采用Revman 5.3软件对总有效率、肺功能指标(FEV1%、FVC、FEV1/FVC)、血气分析指标(PaO2、PaC02)、中医症状积分、生存质量指标的相关数据进行meta分析。2基于数据挖掘技术中药复方治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期用药规律探索运用频数分析、因子分析、聚类分析、关联分析等数据挖掘方法探究COPD稳定期的基本治则、常用治法、药物选择与配伍规律。3基于网络药理学技术七味都气丸化裁方治疗C OPD稳定期的机制探索利用TCMSP和BATMAN-TCM数据库筛选出七味都气丸化裁方的活性成分及靶点。通过OMIM及Genecrds数据库获取COPD的相关基因,筛选药物和疾病的关键交集基因,并根据交集基因构建PPI蛋白互作网络、进行基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。4基于MKK3/6-P38 MAPK信号通路七味都气丸化裁方干预COPD稳定期的疗效和机制实验研究4.1分组与给药将60只Wistar雄性大鼠采用随机数字表法,随机分为空白组和造模组,空白组12只,造模组48只。造模成功后,将造模组大鼠随机分为3组,即模型组、氨茶碱组、中药组。对造模组采用气管滴注脂多糖联合持续熏烟法复制COPD大鼠模型,造模28天。造模结束次日开始进行灌胃给药。空白组和模型组日二次以生理盐水灌胃;氨茶碱组和中药组分别以相应药物灌胃,其中氨茶碱组日二次灌胃,早灌胃为0.3125mg/mL氨茶碱混悬液,晚为同等体积生理盐水;中药组日二次采用0.452g/ml中药液灌胃。各组每次灌胃药液体积均为1mL/100g,每周称量一次大鼠体重,根据体重变化情况调整灌胃药量,灌胃共计28天。4.2取材所有大鼠取材前12h内禁食不禁水,造模后第57天进行取材,处死大鼠,采集样本。以10%水合氯醛过量麻醉处死大鼠,取肺组织,制备肺泡灌洗液。4.3研究内容采用HE染色方法观察各组大鼠肺组织病理变化;E1isa法检测大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-a、IEN-γ表达水平;Western-Blot 法检测大鼠肺组织中 BaxB cl-2、Fas/FasL、MKK3/p-MKK3、MKK6/p-MKK6、p38 MAPK/p-p38 MAPK 表达水平;RT-PCR 法检测大鼠肺组织中 Bax/B cl-2、Fas/FasL、MKK3、MKK6、p38 MAPKmRNA转录水平。4.4统计方法实验结果采用SPSS19.0软件统计,计量资料数据以均数加减标准差(x±S)表示,两组比较用t检验,多组比较用方差分析,P<0.05被认为统计学上具有显著性意义结 果:1中药复方治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期有效性及安全性系统评价与meta分析与西医常规治疗相比,中药复方联合西医常规治疗干预COPD总有效率显著升高;能够更好的改善肺功能部分指标:提高FEV1%、FVC、FEV1/FVC;改善血气分析指标:提高PaO2值、降低paCO2值;降低中医症状评分:降低咳嗽评分、降低咳痰评分;改善生活质量:提高6MWT值;减少CAT评分值;降低mMRC值;降低BODE指数值。且具有良好的安全性。2基于数据挖掘技术中药复方治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期用药规律探索中药复方治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期的数据挖掘共收录方剂232首,涉及中药206味。根据频数分析结果可知,单味药用药频率较高的是黄芪、甘草、茯苓等;药物种类以补虚药、化痰止咳平喘药、利水渗湿药等居多;药性多为温性、平性、微温;五味中,以甘味、苦味和辛味较为常见;归经以归肺脾两经药物较常选用。因子分析共提取17个公因子,主要体现扶正祛邪的基本治则。扶正包含的治法主要有补益肺肾、益气滋阴、敛肺固表等;祛邪主要包括化痰、祛湿、通络、活血等。基于治则,反映出COPD稳定期本虚标实的基本病机。对于公因子的药物组合进行分析发现,主要为六味地黄丸、二陈汤、三子养亲汤、七味都气丸等经典方剂的药物核心组成。聚类分析结果得出了泽泻-丹皮、白芍-桂枝、柴胡-川芎、陈皮-半夏、党参-白术-茯苓-甘草、熟地-山茱萸-山药等药对/药组,可为今后临证处方提供参考。3基于网络药理学技术七味都气丸化裁方治疗COPD稳定期的机制探索应用网络药理学技术,共筛选七味都气丸化裁方中99个活性成分,352个靶点,C OPD疾病相关的基因5762个,筛选交集基因发现中药复方七味都气丸化裁方治疗COP D疾病的可能靶点共有253个,位于蛋白互作网络中心的靶点有MAPK1、MAPK3、T NF、IL6、FOS、JUN等。GO功能分析结果提示:相关的靶基因涉及的功能途径主要有脂多糖反应、活性氧反应、核受体活性、辅因子结合、膜筏、受体复合体等;KEGG通路富集结果提示:MAPK信号通路、NF-κB信号通路、细胞凋亡、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、cAMP信号通路等多种信号途径可能作为七味都气丸化裁方作用于COPD的靶点。4基于MKK3/6-p38 MAPK信号通路七味都气丸化裁方干预COPD稳定期的疗效和机制实验研究4.1大鼠一般状态和肺组织病理结果:氨茶碱组和中药组可明显改善大鼠的咳嗽、呼吸急促等症状,且中药组效果优于氨茶碱组。肺组织病理结果示,空白对照组大鼠肺泡大小均匀,肺泡壁薄厚适中,未见炎性细胞浸润。模型组肺泡壁增厚,肺泡不均匀,肺泡壁可见大量炎性细胞浸润。与模型组相比,氨茶碱组、中药组肺组织病理改变均有不同程度的减轻。4.2炎症因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ表达水平:与空白组相比,造模组各组大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α、IFN-γ达水平均出现不同程度上调;与模型组比较,氨茶碱组、中药组IL-1β、TNF-α、IFN-γ表达水平显著下调,且中药组下调程度更明显。4.3凋亡分子及通路关键节点蛋白表达水平4.3.1 Bax/Bcl-2:与空白组相比,造模组大鼠肺组织中Bax蛋白表达水平显著上调、Bcl-2蛋白表达水平显著下调。与模型组比较,氨茶碱组、中药组Bax蛋白表达水平显著下调,且中药组下调水平较氨茶碱组更为显著;B cl-2蛋白表达水平显著上调,且中药组上调水平较氨茶碱组更为显著。4.3.2 Fas、FasL:与空白组相比,造模组大鼠肺组织中Fas、FasL蛋白表达水平显著上调;与模型组比较,氨茶碱组、中药组Fas、FasL蛋白表达水平显著下调,且中药组下调水平较氨茶碱组更为显著。4.3.3 MKK3/p-MKK3:与空白组相比,造模组大鼠肺组织中MKK3蛋白表达水平显著下调、p-MKK3蛋白表达水平显著上调。与模型组比较,氨茶碱组、中药组MKK3蛋白表达水平显著上调,且中药组上调水平较氨茶碱组更为显著;p-MKK3蛋白表达水平显著下调,且中药组下调水平较氨茶碱组更为显著。4.3.4 MKK6/p-MKK6:与空白组相比,造模组大鼠肺组织中MKK6蛋白表达水平显著下调、p-MKK6蛋白表达水平显著上调。与模型组比较,氨茶碱组、中药组MKK6蛋白表达水平显著上调,且中药组上调水平较氨茶碱组更为显著;p-MKK6蛋白表达水平显著下调,且中药组下调水平较氨茶碱组更为显著。4.3.5 p38 MAPK/p-p38 MAPK:与空白组相比,造模组大鼠肺组织中p38 MAPK蛋白表达水平显著下调、P-P38 MAPK蛋白表达水平显著上调。与模型组比较,氨茶碱组、中药组p38 MAPK蛋白表达水平显著上调,且中药组上调水平较氨茶碱组更为显著;p-p38 MAPK蛋白表达水平显著下调,且中药组下调水平较氨茶碱组更为显著。4.4 mRNA 表达4.4.1 Bax/Bcl-2:与空白组相比,造模组大鼠肺组织中Bax mRNA表达水平显著上调、Bcl-2 mRNA表达水平显著下调。与模型组比较,氨茶碱组、中药组Bax mRNA表达水平显著下调,且中药组下调水平较氨茶碱组更为显著;Bcl-2 mRNA表达水平显著上调,且中药组上调水平较氨茶碱组更为显著。4.4.2 Fas/FasL:与空白组相比,造模组大鼠肺组织中Fas、FasL mRNA表达水平均显著上调。与模型组比较,氨茶碱组、中药组Fas、FasL mRNA表达水平显著下调,且中药组下调水平较氨茶碱组更为显著。4.4.3 MKK3、MKK6、p38 MAPK:造模各组大鼠肺组织中 MKK3、MKK6、p38 MAPK mRNA转录水平与空白组接近,差异均无统计学意义。结 论:1.系统评价与meta分析结果提示中药复方联合西医常规治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期与单纯西医常规治疗相比,总有效率更高,对肺功能指标、血气分析指标缓解更显著,可降低中医症状评分、改善生活质量,且具有良好的安全性。2.数据挖掘研究结果提示慢性阻塞性肺疾病稳定期本病病位在肺,继而累及脾、肾,久则伤及心、肝,其基本病机为本虚标实,本虚以气虚为主,标实以痰湿为主。扶正祛邪为COPD稳定期治则,扶正包含的治法主要有补益肺肾、益气滋阴、敛肺固表等;祛邪主要包括化痰、祛湿、通络、活血等。临证处方多以六味地黄丸、七味都气丸、二陈汤等为基根据病情酌情加减治疗。药物选择多选用补气药、化痰药、祛湿药等,以温性、平性,归肺经、脾经等及甘、苦、辛味药物较常选用。聚类分析与关联分析得出了部分纳入方剂的常用配伍,可为今后临证处方提供参考。3.根据网络药理学研究结果显示,具有补益肺肾,化痰通络之功效的中药复方七味都气丸化裁方可能通过多靶点、多途径治疗COPD。本方涉及药物活性成分99个,潜在靶点352个,疾病涉及基因5762个。结果筛选共获得交集基因253个;交集基因GO富集分析结果提示七味都气丸化裁方调控的基因主要涉及脂多糖反应、活性氧反应、核受体活性、辅因子结合、膜筏、受体复合体等功能途径;KEGG富集分析结果提示MAPK信号通路、NF-κB信号通路、细胞凋亡、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、cAMP信号通路等多种信号途径可能作为潜在靶点在七味都气丸化裁方干预COPD中发挥重要作用。其中,MAPK信号通路与COPD发生发展密切相关,因此调控MAPK信号通路可能为七味都气丸化裁方干预COPD的潜在切入点。以此为基础在下一研究中,通过实验验证七味都气丸化裁方治疗COPD的作用机制与MAPK信号通路与细胞凋亡的内在联系。4.动物实验证实七味都气丸化裁方可通过下调IL-1β、TNF-α、IFN-γ炎症因子表达水平,下凋MKK3、MKK6、p38 MAPK蛋白磷酸化水平,抑制MKK3/6-p38 MAPK信号通路,进而调控内源性、外源性细胞凋亡途径发挥治疗C OPD稳定期的作用。