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细胞凋亡是生物体一种调节细胞群体相对恒定的重要方式，近年已成为生命科学中一个非常热门的研究热点。细胞凋亡早期的特征是磷脂酰丝氨酸基团（PS）的外翻，能与PS高度特异性结合的Annexin V成为了研究早期细胞凋亡的重要标识物。近年在分子核医学显像研究中，用放射性核素标记Annexin V的凋亡显像剂研究也取得了很大的进步，这对提高对疾病的认识、评价指导疾病的治疗以及新药的开发等都具有重要的意义。 本论文研究的主要目的是在已有的文献基础上，利用国内基因工程技术制备的重组的人Annexin V进行放射性核素的标记和评价，希望制备出可用于临床细胞凋亡研究的显像剂。本论文的主要研究内容如下： 1、重组Annexin V的制备纯化 研究了工程菌的诱导表达和蛋白质的纯化。建立了Annexin V工程菌诱导表达的最佳温度、时间和包涵体的操作程序，并通过离子层析纯化后得到了高纯度的Annexin V。 2、131/125I-Annexin V的制备研究研究了131/125I-Annexin V的标记条件和稳定性，建立了纸色层和高压液相的分析方法。采用Iodo-Gen标记法，反应10min后，131/125I-Annexin V的标记率大于80％，经PD-10纯化后，其放化纯大于95％。标记物在室温下稳定性较好。ITLC-SG薄层分析，展开体系为正丁醇/乙醇/氨水（5/1/2），Rf：标记物=0.0-0.1，Γ=0.5-0.7，碘酸=0.7-0.9。HPLC：GF250色层柱，流动相为0.01mmol/LPBS，流速为1.0ml/min，保留时间：标记物为6.3min，游离碘为9.7min。3、99mTc-HYNIC-Annexin V的制备研究研究了双功能偶联剂的S-HYNIC的合成、偶联剂与Annexin V的连接和99mTc-HYNIC-Annexin V的标记以及纯化，建立了薄层分析和高压液相的分析方法。（1）合成的S-HYNIC经元素分析、IR、1H-NMR、快原子质谱确证为所预期的化合物。解决了合成中关键的第三和第四步中3个难点：除去DMF、无水和去BOC问题。（2）偶联条件：1mol Annexin V（5.5mg/mL）与6mol S-HYNIC在HEPES溶液中避光反应5h，每个Annexin V连接上2个HYNIC，比文献值中国原子能科学研究院博士学位论文 高一倍。首次研究了缓冲溶液对偶联的影响。（3）通过“3+1”的二元混合配 体络合的方案，以Tricine作为协同试剂，氯化亚锡作为还原剂，室温反应30min 后，制备得放化纯>95%的”9’”几一H翎xe一Annexinv。标记物t匕活度为26.sMBq 恤gAnnexinV，比文献值要高2倍以上。4、生物学评价和动物实验 研究了”’‘’2’I一Annexinv、”9nl介一H州le一Annexinv的体内外生物学性质和动 物实验。（l）”51一Annexinv能在体外检测细胞的凋亡，与FITc一Annexinv流 式细胞分析的结果能较好的吻合。首次初步建立了’2，I一Annexinv体外细胞凋 亡的放射配基结合分析的基础。（2）通过细胞结合分析定量测定了Annexinv 的生物活性，Ko=8.53士3.3OnmolzL，盯一8.79士2.2Inmol/L。（3）正常小鼠体内分 布表明:’2行一Annexinv主要浓聚于肝、脾、肾，在体内易脱碘:”gmTc- HYNIC一AnnexinV主要浓聚于肝、脾、肾和肺，从肾脏排泄。（4）通过sn大 鼠凋亡模型的分布和显像实验:确定了环磷酞胺诱导骨髓内细胞的凋亡（主 要在脾脏和股骨等脏器）的最佳时间为72h:首次确定了’3’I一Annexinv的最 佳凋亡显像时间为6h，”glllTc一HYNIc一Annexinv为3h。（5）环磷酞胺诱导凋亡 的动态显像结果表明，注射”gmTc一HYNIc一Annexinv后，实验组与对照组的 股骨的放射性浓聚比值随时间的增加而增加，在lh后增加的速率放慢，3h达 到最大。验证了3h为”gmTc一HYNIc一Allnexinv的最佳凋亡显像时间。 总之，本论文是首次利用国内制备的重组人AnnexinV进行放射性核素的标记和评价，其中用’2，I一Annexinv进行体外细胞凋亡的放射配基结合分析，以及确定”’l一Annexinv和”gm几一H洲Ie一Annexinv的最佳凋亡显像时间的实验，还未见有文献报道。现有的实验结果表明:’2，I一Armexinv能在体外检测细胞的凋亡;制备的’3’‘’2，I一Annexinv和”9，，，几一H州Ie一Annexinv可以有效检测鼠类体内的细胞凋亡，特别是”gmTc一HYNIc一Annexinv将会成为临床上一种很有前景的体内细胞凋亡显像剂。