绿色木霉葡聚糖内切酶基因的克隆和表达研究

来源 :广西大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:zhut2009
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纤维素酶主要分为三类:(1).葡聚糖外切酶(exo-1,4-β-D-glucana-ses)又称纤维二糖酶(cellobiohydrolases,简称CBH);(2).葡聚糖内切酶(endo-1,4-,β-D-glucanases,简称EG);(3).β—葡萄糖苷酶(1,4-β-D-glucosidases简称BG),三种组分协同作用,最终将纤维素水解生成葡萄糖;产纤维素酶的菌主要时有丝真菌,尤其是木霉、曲霉等,木霉产的纤维素酶主要是葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶,而曲霉主要是产β—葡萄糖苷酶能力较强。纤维素酶的合成成受纤维素、乳糖(lactose)、纤维二糖(cellobiose)、槐二糖(sophorose)和L-山梨糖(L-Sorbose)等的诱导。本文用L-山梨糖诱导绿色木霉AS3.3711纤维素酶基因的转录,在诱导9-12h时,葡聚糖内切酶的mRNA转录量达到峰值,收集菌丝体提取总RNA,反转录获得cDNA。以单链cDNA为模板,PCR扩增得到了编码葡聚糖内切酶Ⅰ的cDNA基因(egl1)和编码葡聚糖内切酶Ⅲ的cDNA基因(egl3),去除egl1和egl3的信号肽序列后分别构建了重组质粒pET-egl1和pSE-egl3,并实现了其在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE分析大肠杆菌的表达产物,结果表明egl1基因在大肠杆菌中表达的蛋白分子量约46.2kDa;egl3基因在大肠杆菌中表达的蛋白质分子量约42kDa。CMC酶活检测发现大肠杆菌表达的EGI没有酶活,大肠杆菌表达的EGⅢ检测到胞内酶活,每毫升菌液所含葡聚糖内切酶的活力为0.04U/ml。将含信号肽的egl1基因,克隆到酿酒酵母表达载体pYES2中,构建了重组质粒pYES2-egl1,转化酿酒酵母菌INVscl,β-D-半乳糖诱导EGI的表达,用刚果红染色法筛选重组转化子。酿酒酵母能够识别EGI自身携带的信号肽,而将表达产物分泌到胞外,故在CMC筛选平板上用刚果红染色法检测,有清晰的水解圈。用80%饱和度的硫酸铵从2ml菌液上清中沉淀酶蛋白,重悬于1ml的0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH4.8),CMCase测定结果显示,酿酒酵母INVsvl表达的EGI最适反应温度为47℃,最适反应pH为5.2,在诱导70h时酶活达到最高值,约为0.08U/ml。
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