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第一部分常见呼吸道病毒快速细胞培养与鉴定体系的建立背景:病毒的实验室检测方法有病毒分离培养、病毒核酸分子生物学检测、病毒直接检查、血清学试验检测病毒特异性抗体等。在国外发达国家的临床实验室,病毒检测技术均比较成熟,但国内病毒检测技术普及程度低,全国的大型综合医院大多没有常规进行临床呼吸道病毒检测。少数开展病毒检测的医院,病毒检测手段相对单一,较少应用病毒诊断的“金标准”—病毒分离,多数仅应用一至两种病毒学检测方法,如免疫荧光（IF）检测呼吸道分泌物中的病毒抗原、分子生物学技术检测病毒核酸或血清学试验检测病毒特异性IgM抗体等。建立多种病毒诊断方法,包括病毒分离,对呼吸道病毒感染的监测和诊断具有重要的临床意义。目的:改进细胞分离培养技术,联合直接IF检测,建立常见呼吸道病毒快速细胞培养与鉴定体系,并验证该体系的检测敏感性、检测时间和检测通量。方法:采集广东省中医院急诊科成人急性呼吸道感染（ARI）患者和深圳市儿童医院儿童ARI患者的鼻/咽拭子标本,接种到狗肾细胞（MDCK）、恒河猴肾细胞（LLC-MK2）、人鼻咽癌细胞（HEp-2）三种细胞上,同时设置阴性对照。室温3000rpm,离心60min后补加等体积的细胞维持培养液,置34℃、含5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。每周观察细胞病变（CPE）3～4次,于标本接种后36～48h及第5～7天,各吸取50μl MDCK及LLC-MK2培养上清做血凝试验（HAT）。CPE和/或HAT阳性者,以病毒特异性单克隆荧光抗体[甲型流感病毒（Flu A）、乙型流感病毒（Flu B）、呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒（ADV）、副流感病毒1、2、3型（PIV-1、2、3）]做IF鉴定。所有标本接种后7天,对阴性细胞再做IF筛查,阴性者判为阴性,阳性者根据阳性细胞类型选择对应的病毒特异性抗体做IF鉴定。将ATCC标准病毒株,分别接种到对应宿主细胞上,3～7天后刮取细胞作涂片固定后低温保存,在IF时作为阳性对照。结果:①2009年1月至4月期间,共检测拭子标本641份,病毒阳性87份,阳性率13.6%。检出病毒88株（1份标本为Flu A/B双重感染）,其中Flu-A 20株,Flu-B 39株,PIV-1 2株,PIV-2 1株,PIV-3 15株,ADV 8株,RSV 2株。②每块96孔板可接种11份标本,每批接种4块96孔板较为合适,即接种44份标本。③标本接种后,出现阳性结果的平均时间分别为:Flu 2d、ADV 3d、PIV 3-4d,RSV 5d。结论:本次实验建立了一个稳定的呼吸道病毒快速细胞培养与鉴定体系,敏感性好,特异性佳,每批可检测44份标本,得到阳性结果的平均时间约为2～5天,可应用于常见呼吸道病毒分离检测。第二部分成人社区获得性肺炎的病毒病原学及临床特征分析背景:社区获得性肺炎（CAP）是威胁人类健康的最常见感染性疾病之一。在我国,肺炎在所有死因中排第五位。然而,目前对CAP的病原学仍知之不足,大约有17%-48%的CAP患者病原学不明。20世纪以来的几次全球流行性急性呼吸道病毒感染性疾病,如20世纪的4次流感大流行、1997年最先报道于香港的人感染高致病性禽流感、2003年的严重急性呼吸综合征（SARS）等均严重威胁着人类的健康。2009年爆发的全球甲型H1N1流感大流行,截止至2010年3月7日,已导致全球死亡16,713例,其中中国有796例,而未来的流行趋势尚不明朗。我国华南地区因特殊的地理位置、海洋季风气候和农业生产方式,被国际学术界普遍认为是“世界流感中心”。2003年的SARS亦被认为起源于广东。而广州市是我国华南地区的中心大城市,与国际及内地其他城市接触交流频繁。近年来流行病学调查显示病毒性肺炎的发病率高达56%,病毒已被公认为是CAP的重要病原学之一,但是CAP诊治指南并没有提供详细的有关病毒性肺炎的评估和治疗建议。国内目前尚缺乏成人病毒性CAP病原及临床特征的详细资料。目的:检测成人CAP的病毒病原学,分析临床特征。方法:收集2009年4月至2009年12月期间,就诊于广州医学院第一附属医院的CAP患者的鼻/咽拭子、急性期与恢复期（2-4周后）血清,记录病史资料。应用常见呼吸道病毒快速细胞培养与鉴定体系、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测鼻/咽拭子标本,应用血凝抑制试验（HI）、间接IF试验检测急性期与恢复期血清中呼吸道病毒特异性IgG抗体滴度（4倍或以上升高为阳性）。呼吸道病毒快速细胞培养与鉴定、RT-PCR或血清学试验任一项阳性则判断为病毒感染。结果:①最终入选CAP病例149例,男性84例,女性65例,年龄中位数M（四分卫间距IQR）为60（35～77）岁,鼻/咽拭子149份,70例有双份血清。89例患者伴有慢性阻塞性肺疾病等慢性基础疾病。②病毒检测阳性48例,阳性率32.2%。不同年龄段人群,阳性率不同,以16～19岁的青少年（54.5%）及79岁以上的老年人（57.3%）最高,各年龄组的阳性率差异有统计学意义（P=0.023）。单一病毒感染44例（Flu A 24例,Flu B 5例,ADV及PIV-1各2例,PIV-3 11例）,双重病毒感染4例。其中有1例Flu A和1例Flu A+ADV感染患者痰培养检出大肠埃希菌,1例PIV-3感染患者痰培养检出副流感嗜血杆菌。52株病毒中,快速细胞培养与鉴定体系检出18株病毒,RT-PCR检出41株病毒,血清学试验检出21株病毒。有双份血清的70例患者中,与“金标准”病毒培养比较,RT-PCR法的检测敏感性较高（P=0.003）,特异性为80.7%,血清学试验的检测敏感性类似（P=0.118）,特异性为75.4%,③48例病毒性肺炎患者,年龄M（IQR）为58（30～79）岁,男性27例,26例伴有基础疾病。18.8%的病毒性肺炎患者发病前有发热患者接触史,与病毒检测阴性的肺炎患者（9.9%）相比,差异无统计学意义（P=0.13）。④病毒性肺炎病例中,高热≥39℃（66.7%）、乏力（64.6%）、咳脓痰（52.1%）、咽痛（45.8%）、呼吸困难（41.7%）、鼻部症状（41.7%）为最常见的症状。Flu A及PIV-3感染患者可伴有咯血、胸闷胸痛。Flu及PIV-3感染患者呼吸困难及消化道症状亦多见。⑤48例病毒性肺炎患者,两个或以上肺叶病变的比例达56.3%,有6例（12.5%）出现胸腔积液,与病毒检测阴性肺炎患者相比无统计学差异（P=0.384和0.371）。⑥病毒性肺炎患者中,CURB-65评分为中高危及有并发症的比例（20.8%、66.7%）,均有高于病毒检测阴性患者的趋势（13.9%、49.5%）,但无统计学差异（P=0.177和0.063）。54.2%的病毒性肺炎患者需要吸氧,37.5%出现电解质紊乱,明显高于病毒检测阴性组（P=0.008和0.002）。病毒性肺炎患者中,有基础疾病者的呼吸衰竭及肾功能损害等的发生率高于无基础疾病者。结论:1.病毒是CAP的常见病原体之一,在本检测范围内,最常见的病毒病原体是Flu A和PIV-3。2.不同病毒诊断方法的敏感性及适用范围不同。3.根据临床特征不能区分病毒性肺炎和非病毒性肺炎,不能鉴别各种病毒性肺炎。4.病毒性肺炎患者有细菌合并感染的可能。5.有必要对需要住院的社区获得性肺炎病例进行病毒检测,尤其重症患者。