目的药物洗脱支架已被证实可以有效抑制新生内膜增殖和再狭窄的发生。然而,聚合物涂层药物洗脱支架的高分子聚合物长期存留体内,引起内皮愈合延迟以及持续炎症细胞浸润,而这些可能导致晚期支架内血栓形成以及晚期再狭窄等并发症。理论上,无聚合物载体药物洗脱支架在有效抑制新生内膜增殖的同时,可以在一定程度上避免上述晚期不良反应的发生。研究表明E1A激活基因阻遏子是成熟生物体内维持组织和细胞分化的重要分子,在肿瘤细胞诱导分化和抑制损伤血管VSMCs去分化、促进内皮功能恢复中均具有积极的生物学功能。本文选用本室自主研发的人E1A激活基因阻遏子糖蛋白为洗脱药物,纳米微孔支架为平台,利用被动吸附的方法制备纳米微孔人E1A激活基因阻遏子糖蛋白洗脱支架。在制备并检测了纳米微孔人E1A激活基因阻遏子糖蛋白洗脱支架体外特性的基础上,应用小型猪为动物模型评价了纳米微孔人E1A激活基因阻遏子糖蛋白洗脱支架的生物安全性和防治支架内再狭窄的有效性。方法1:将人293F细胞株用Lipofectamine 2000转染,筛选稳定表达的细胞克隆,免疫应迹方法鉴定hCREG/myc-His融合蛋白的表达,糖苷酶法及Western blotting行hCREG/myc-His融合蛋白的糖基化分析。应用Ni-NTA柱纯化CREG糖蛋白,用HiTrap脱盐柱将纯化后的CREG蛋白脱盐。2:将清洗和消毒好的纳米微孔支架在37℃条件下浸泡于缓冲液稀释至0.5mg/ml,1.0mg/ml,1.5 mg/ml的CREG糖蛋白溶液中。采用125I放射性标记单抗CREG蛋白的方法对CREG蛋白在支架上的吸附以及CREGES在体外药代动力学进行了检测。应用免疫荧光的及扫描电镜的方法确定CREG糖蛋白在支架上的吸附。以培养的血管平滑肌细胞和内皮细胞为模型对CREG洗脱支架体外生物活性分析。3:将纳米微孔裸支架、聚合物载体雷帕霉素洗脱支架以及CREG洗脱支架随机植入21头小型猪的前降支、回旋支和右冠脉。在植入后7天、14天和1个月复查造影,并行组织形态学测量以及病理分析。结果:裂解稳定表达pcDNA 3.1 myc-His/hCREG的293F细胞及未转染的对照细胞,行Western blot检测。hCREG抗体,myc抗体及His抗体均检测到大小约为30KD的融合蛋白表达。为证明带有myc和His标签的重组hCREG蛋白为糖基化蛋白,将蛋白用PNGaseF处理,结果发现hCREG融合蛋白分子量由30KD降低至25KD,电泳条带下移。将纯化后CREG糖蛋白以及收集的洗脱液经离心超滤管浓缩后,经BCA法测定并与蛋白标准曲线比较,发现重组hCREG蛋白浓度为1.6 mg/mL,测量纯度为93%。浓缩并脱盐后的纯化蛋白经PNGaseF处理后分子量由30KD降至25KD,证实纯化后的蛋白仍保留了糖基化形式。125I放射标记单抗的方法对CREG白在支架上的吸附以及CREG蛋白在体外的释放进行了定量的检测。从吸附实验的结果来看, CREG蛋白在支架上的吸附量与蛋白溶液的浓度和吸附时间有关。实验检测了支架在三种不同的蛋白浓度中吸附48h的实验数据,最大的蛋白吸附量是在1.5mg/ml的蛋白溶液中吸附24h时得到的。支架上蛋白的释放时间可达到2周以上。为了研究CREGES体外生物学效应及蛋白稳定性,直接将支架置入内皮细胞及平滑肌细胞的培养皿中,观察其对内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响。结果显示在3天和4天时与BMS相比,CREGES组内皮细胞数明显增高(P﹤0.05),而PARNTER组内皮细胞数明显减少(P﹤0.05)。在平滑肌增殖试验研究表明CREG可以显著抑制平滑肌细胞增殖,在4天、6天及8天时与BMS相比CREGES及PARTENER支架可以明显抑制平滑肌细胞增殖(P﹤0.05),而CREGES及PARTENER支架对平滑肌细胞增殖影响无差别。但是在10天时PARTENER支架抑制平滑肌细胞增殖程度显著强于CREGES及BMS(P﹤0.05)。在体研究结果表明CREGES具有良好的安全性,未发现支架内血栓和支架周围炎症。3组冠状动脉大小和血管损伤积分程度无显著差异。4周时,3组支架均观察到不同程度的内膜增生。4周时各组间管腔面积及中膜面积无显著差异,但是各组间新生内膜面积存在显著差异(p=0.01),其中PARNTER组及CREG组新生内膜面积较BMS组显著减少,而PARNTER组及CREG组间新生内膜面积无显著差异(p=0.87)。同时,各组间管腔狭窄程度存在显著差异(p<0.01),其中BMS组管腔狭窄程度比PARNTER组(48%±4% vs. 15%±4%, p<0.01)及CREG组(48%±4% vs.20%±3%, p<0.01)明显增大,PARNTER组与CREG组间管腔狭窄程度无显著差异(20%±4% vs. 15%±3%, p=0.06)。免疫组化显示a-SMC-actin含量及CD68阳性指数在3组之间无差别。但是,CREGES组及PARNTER组的细胞增殖标记物Ki67指数明显高于BMS组,而CREGES组与PARNTER组Ki67指数无显著差别。为了研究3种支架对内皮化程度的影响,本研究进行了在不同时间点进行CD31染色并且计算了内皮化积分。结果显示7天时3组血管表面粗糙,很少有内皮覆盖。14天时CREGES组内皮化程度较PARNTER组BMS组明显增高,而PARNTER组及BMS组内皮化程度无差别。28天时CREGES组及BMS组已经基本内皮化,内皮化程度,无差别,而PARNTER组内皮覆盖不完全,内皮化程度较PARNTER组及BMS组明显减低。结论: CREGES在小型猪模型中,植入1个月可以有效抑制新生内膜形成,并且表现出良好的安全性。其长期有效性有待于进一步研究证实。