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真核细胞中，内质网(Endoplasmic Reticulum，ER)作为细胞内膜面积最大的细胞器，能与不同的膜细胞器，形成紧密接触的特殊区域——膜接触位点(Membrane Contact Sites，MCSs)。ER与质膜(Plasma Membrane，PM)之间形成的MCSs，依赖蛋白的系链作用，保持动态或瞬态的7-30nm范围内的微小距离，对细胞内的Ca2+信号传导和脂质运输具有重要意义。
胰岛β细胞动作电位的复极是由延迟整流钾电流介导的，电压门控钾通道(Kv)亚型Kv2.1通道是延迟整流钾电流的主要组成成分，在β细胞高水平表达。前期有研究发现β细胞KV2.1通道的表达非常丰富，但采用通道特异性抑制剂抑制这些通道活动(包括相关的KV2.2通道)对β细胞动作电位影响不大，对胰岛素的分泌活动也没有影响。然而有多个研究小组报道，采用KV2.1敲除小鼠揭示KV2.1通道蛋白的敲除改变了葡萄糖诱导的胰岛β细胞的电活动，促进了胰岛素的分泌。总之，Kv2.1通道和KV2.2通道在胰岛素分泌中的作用仍存在矛盾和争议，需要进一步探索Kv2通道与β细胞分泌功能的相关性及其分子机制。最近研究表明，Kv2.1通道存在于ER-PM连接处，参与神经元ER-PM接触点的形成，是一种新的ER-PM接触点链接蛋白，在细胞膜上形成簇状结构，然而其生理功能仍未阐明。
本研究证实了KV2.1通道对β细胞分泌活动的调控作用，是促使ER-PMMCSs形成的调控结构，观察到KV2.1通道与囊泡关联膜蛋白关联蛋白A(VAPA)的直接相互作用，并分析了这种ER-PM互作关系与β细胞分泌活动的相关性。
1.Kv2.1通道对胰岛β细胞分泌活动的调控作用为了证实KV2.1通道在β细胞胰岛素分泌的调节作用，检测沉默KV2.1蛋白基因和限制电流传导对β细胞系INS-1细胞胰岛素胞吐作用的影响。膜片钳膜电容测量技术结果显示：SiRNA敲低INS-1细胞Kv2.1通道蛋白的表达能显著抑制囊泡的分泌，而Kv2.1通道特异性阻断剂STX(stromatoxin)虽能显著阻断外向性钾电流，但对囊泡分泌活动没有影响。以上结果证实了KV2.1通道不导电时，具有影响囊泡分泌的作用。
2.Kv2.1通道在β细胞ER-PM接触点的形成为了确认不导电的KV2.1通道在β细胞ER-PM分布情况。用EGFP荧光标记KV2.1过表达INS-1细胞，采用共聚焦激光扫描成像技术，在细胞底部和中部扫描成像显示：KV2.1通道在INS-1细胞形成斑片状的结构分布。为了进一步验证在Ca2+内流下，KV2.1通道对胰岛素分泌的影响。用Kv2.1-EGFP和mCherry-STIM1共转INS-1胞，设置对照组和TG组。TG(Thapsigargin)是一种Ca2+-ATP酶抑制剂,可通过打开细胞膜钙离子通道致细胞内Ca2+池释放,从而使细胞内Ca2+浓度升高。采用共聚焦激光扫描成像技术，在细胞底部成像显示：相对于对照组，TG组明显诱导STIM1迁移到KV2.1介导的ER-PM接触位，与KV2.1高度共定位。STIM1在前期研究发现是β细胞分泌的调节蛋白。以上实验结果确认了KV2.1通道在ER-PMMCSs形成的高密度聚集结构，并参与β细胞受Ca2+内流诱导的分泌过程。
3.Kv2.1通道与VAPA互作介导β细胞ER-PM接触点的形成为了研究KV2.1通道与VAPA的互相作用，介导了ER-PM的膜接触。用EGFP荧光标记KV2.1蛋白，mCherry标记VAPA蛋白。在内源性HEK293细胞分别过表达EGFP-KV2.1和共表达EGFP-KV2.1+mCherry-VAPA。利用共聚焦扫描细胞底部成像显示：单转入KV2.1时，KV2.1在PM上均匀分布，不形成簇状典型结构；共转入KV2.1和VAPA时，KV2.1与VAPA高度共定位并在膜上形成簇状分布。内源性HEK293细胞不表达VAPs蛋白。为了进一步确认KV2.1与VAPA形成互作的分子机制，用EGFP-Kv2.1和VAPA的碱基点突变体mCherry-VAPA(K94D/M96D)共转INS-1细胞，共聚焦扫描细胞底部成像发现：显著抑制了Kv2.1通道介导的簇状结构的形成。以上实验数据证明了KV2.1能与VAPA构建正确联系介导ER-PM的接触。
4.FRET实验证实Kv2.1通道与VAPA直接相互作用为了验证ER-PM中，KV2.1与VAPA的直接相互作用，用荧光Clover2和mRuby2分别标记KV2.1和VAPA，并分别将Clover2-N1+mRuby2-VAPA和Clover2-KV2.1+mRuby2-VAPA共转INS-1细胞。Clover2、mRuby2分别用488nm和559nm激发，并分别用500-530nm和570-625nm记录供体荧光基团Clover2和受体荧光基团mRuby2的荧光强度。利用共聚焦FRET成像技术获取供体通道、FRET通道、受体通道荧光图像，计算出Nfret值：显示Clover2-Kv2.1和mRuby2-VAPA存在明显的FRET现象，Clover2-N1和mRuby2-VAPA无明显的FRET现象。这些结果提示Kv2.1通道与VAPA蛋白共处同一ER-PM接触点，直接链接维系了该ER-PM接触点的形成。
5.Kv2.1通道介导的ER-PM接触点促进β细胞分泌功能在研究KV2.1通道与VAPA介导的ER-PM对β细胞分泌的影响，将WT-INS-1细胞作为对照组，Clover2-Kv2.1和mRuby2-VAPA共转INS-1细胞作为阳性组，Clover2-Kv2.1和mRuby2-VAPA(K94D/M96D)共转INS-1细胞作为阴性组，均加入高糖(20mM)刺激处理1小时。采用放免法检测胰岛素分泌量显示：阳性组显著高于对照组含量，阴性组显著低于对照组。这些实验数据表明KV2.1与VAPA构建ER-PM的接触时，促进了β细胞分泌的功能；失去VAPA介导，则减少了胰岛素分泌。
结论：KV2.1通道是胰岛β细胞的分泌功能的重要调节蛋白，其与VAPA蛋白直接相互作用维系了ER-PM接触位点的形成，这种ER-PM接触位点与KV2.1通道调控胰岛β细胞分泌功能分子机制密切相关。
胰岛β细胞动作电位的复极是由延迟整流钾电流介导的，电压门控钾通道(Kv)亚型Kv2.1通道是延迟整流钾电流的主要组成成分，在β细胞高水平表达。前期有研究发现β细胞KV2.1通道的表达非常丰富，但采用通道特异性抑制剂抑制这些通道活动(包括相关的KV2.2通道)对β细胞动作电位影响不大，对胰岛素的分泌活动也没有影响。然而有多个研究小组报道，采用KV2.1敲除小鼠揭示KV2.1通道蛋白的敲除改变了葡萄糖诱导的胰岛β细胞的电活动，促进了胰岛素的分泌。总之，Kv2.1通道和KV2.2通道在胰岛素分泌中的作用仍存在矛盾和争议，需要进一步探索Kv2通道与β细胞分泌功能的相关性及其分子机制。最近研究表明，Kv2.1通道存在于ER-PM连接处，参与神经元ER-PM接触点的形成，是一种新的ER-PM接触点链接蛋白，在细胞膜上形成簇状结构，然而其生理功能仍未阐明。
本研究证实了KV2.1通道对β细胞分泌活动的调控作用，是促使ER-PMMCSs形成的调控结构，观察到KV2.1通道与囊泡关联膜蛋白关联蛋白A(VAPA)的直接相互作用，并分析了这种ER-PM互作关系与β细胞分泌活动的相关性。
1.Kv2.1通道对胰岛β细胞分泌活动的调控作用为了证实KV2.1通道在β细胞胰岛素分泌的调节作用，检测沉默KV2.1蛋白基因和限制电流传导对β细胞系INS-1细胞胰岛素胞吐作用的影响。膜片钳膜电容测量技术结果显示：SiRNA敲低INS-1细胞Kv2.1通道蛋白的表达能显著抑制囊泡的分泌，而Kv2.1通道特异性阻断剂STX(stromatoxin)虽能显著阻断外向性钾电流，但对囊泡分泌活动没有影响。以上结果证实了KV2.1通道不导电时，具有影响囊泡分泌的作用。
2.Kv2.1通道在β细胞ER-PM接触点的形成为了确认不导电的KV2.1通道在β细胞ER-PM分布情况。用EGFP荧光标记KV2.1过表达INS-1细胞，采用共聚焦激光扫描成像技术，在细胞底部和中部扫描成像显示：KV2.1通道在INS-1细胞形成斑片状的结构分布。为了进一步验证在Ca2+内流下，KV2.1通道对胰岛素分泌的影响。用Kv2.1-EGFP和mCherry-STIM1共转INS-1胞，设置对照组和TG组。TG(Thapsigargin)是一种Ca2+-ATP酶抑制剂,可通过打开细胞膜钙离子通道致细胞内Ca2+池释放,从而使细胞内Ca2+浓度升高。采用共聚焦激光扫描成像技术，在细胞底部成像显示：相对于对照组，TG组明显诱导STIM1迁移到KV2.1介导的ER-PM接触位，与KV2.1高度共定位。STIM1在前期研究发现是β细胞分泌的调节蛋白。以上实验结果确认了KV2.1通道在ER-PMMCSs形成的高密度聚集结构，并参与β细胞受Ca2+内流诱导的分泌过程。
3.Kv2.1通道与VAPA互作介导β细胞ER-PM接触点的形成为了研究KV2.1通道与VAPA的互相作用，介导了ER-PM的膜接触。用EGFP荧光标记KV2.1蛋白，mCherry标记VAPA蛋白。在内源性HEK293细胞分别过表达EGFP-KV2.1和共表达EGFP-KV2.1+mCherry-VAPA。利用共聚焦扫描细胞底部成像显示：单转入KV2.1时，KV2.1在PM上均匀分布，不形成簇状典型结构；共转入KV2.1和VAPA时，KV2.1与VAPA高度共定位并在膜上形成簇状分布。内源性HEK293细胞不表达VAPs蛋白。为了进一步确认KV2.1与VAPA形成互作的分子机制，用EGFP-Kv2.1和VAPA的碱基点突变体mCherry-VAPA(K94D/M96D)共转INS-1细胞，共聚焦扫描细胞底部成像发现：显著抑制了Kv2.1通道介导的簇状结构的形成。以上实验数据证明了KV2.1能与VAPA构建正确联系介导ER-PM的接触。
4.FRET实验证实Kv2.1通道与VAPA直接相互作用为了验证ER-PM中，KV2.1与VAPA的直接相互作用，用荧光Clover2和mRuby2分别标记KV2.1和VAPA，并分别将Clover2-N1+mRuby2-VAPA和Clover2-KV2.1+mRuby2-VAPA共转INS-1细胞。Clover2、mRuby2分别用488nm和559nm激发，并分别用500-530nm和570-625nm记录供体荧光基团Clover2和受体荧光基团mRuby2的荧光强度。利用共聚焦FRET成像技术获取供体通道、FRET通道、受体通道荧光图像，计算出Nfret值：显示Clover2-Kv2.1和mRuby2-VAPA存在明显的FRET现象，Clover2-N1和mRuby2-VAPA无明显的FRET现象。这些结果提示Kv2.1通道与VAPA蛋白共处同一ER-PM接触点，直接链接维系了该ER-PM接触点的形成。
5.Kv2.1通道介导的ER-PM接触点促进β细胞分泌功能在研究KV2.1通道与VAPA介导的ER-PM对β细胞分泌的影响，将WT-INS-1细胞作为对照组，Clover2-Kv2.1和mRuby2-VAPA共转INS-1细胞作为阳性组，Clover2-Kv2.1和mRuby2-VAPA(K94D/M96D)共转INS-1细胞作为阴性组，均加入高糖(20mM)刺激处理1小时。采用放免法检测胰岛素分泌量显示：阳性组显著高于对照组含量，阴性组显著低于对照组。这些实验数据表明KV2.1与VAPA构建ER-PM的接触时，促进了β细胞分泌的功能；失去VAPA介导，则减少了胰岛素分泌。
结论：KV2.1通道是胰岛β细胞的分泌功能的重要调节蛋白，其与VAPA蛋白直接相互作用维系了ER-PM接触位点的形成，这种ER-PM接触位点与KV2.1通道调控胰岛β细胞分泌功能分子机制密切相关。