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前言 肺癌的发生是多因素多步骤渐进演变过程。近来研究表明细胞周期与细胞癌变密切相关，许多癌基因、抑癌基因参与了细胞周期的调控，或者其本身就是细胞周期的组成部分，它们的改变导致了细胞周期的失控，表现为细胞的失控性生长，可以说，肿瘤是一类细胞周期疾病。 目前在细胞周期调控上存在两个重要通路：p14ARF-p53通路和p16INK4a-RB通路，他们在G1→S和G2→M限制点中起到关键作用。p14ARF和p16INK4a基因同位于人染色体9p21的CDKN2A位点上，此位点存在不同的阅读框架，通过不同的剪接方式编码了不同的转录子mRNA。p16INK4a和p14ARF基因共用外显子E2和外显子E3，但具有各自独立的外显子E1α和外显子E1β，分别编译p16INK4a蛋白和p14ARF蛋白。 p16INK4a蛋白是细胞周期依赖性蛋白激酶抑制家族成员，能与CyclinD竞争性结合CDK4／6，从而抑制CDK4／6的激酶活性，使pRb去磷酸化，继续保持Rb扣留转录因子E2F的作用，阻断细胞增殖于G1期。 人们一直以鼠的同源蛋白p19ARF作为对象研究p14ARF基因的功能特性。Kamijo采用基因敲除技术（knock-out），将小鼠INK4a／ARF外显子E1β去除，而不影响p16INK4a的正常表达，用DMBA处理出生后不久的ARF-/-小鼠，结果发现这种小鼠很早发生了肿瘤，但在同一时期的ARF+/-和ARF+/+小鼠不发生肿瘤，指出p14ARF是一个真正的抑癌基因。p14ARF蛋白直接结合并抑制MDM2的活性，使其不能介导p53的降解，p53蛋白启动p21cipl的转录并诱导其引起G1期和G2期限制点的停顿。 近年来研究表明在多种人类肿瘤中，INK4a／ARF位点经常发生缺失、突变和甲基化改变，提示p14ARF基因异常在肿瘤发生发展过程中起到重要作用。同时肿瘤组织中p14ARF、p16INK4a和p53蛋白经常发生缺失，与增殖细胞永生化以及肿瘤的发生密切相关，成为近来研究的热点。 人们对基因p16INK4a和p53异常有较深入的研究，但有关p14ARF的研究目前报道不多，而且多集中在体外细胞系培养方面，在人类实体瘤特别是肺肿瘤方面报道甚少。尚未见到肺肿瘤中三者相互关系的研究报道。 我们采用免疫组化（IHC）和蛋白印迹(tem bloo方法、PCR一PAGE和PcR一sscP方法以及MsP和RE一PcR方法对p14人RF、pl6IN执和户3蛋白在非小细胞肺癌（non一small eell lung can单r，NSCLC）中表达情况、pl4ARF基因的杂合性缺失（肠55 of HeteIDzygosity，LOH）、纯合性缺失和外显子突变情况以及p14人Rr启动子区甲基化状态进行了检测，并对他们的临床病理学意义进行了的分析和探讨。方法 一、实验材料 标本源于中国医科大学附属第一医院胸外科2002年7月-2佣2年12月间新鲜手术标本，术后1一3h内获得，一70℃冰箱保存。术后均经病理学确诊。其中肺鳞癌和肺腺癌各20例;低分化癌17例，中分化癌14，高分化癌9例;男性25例，女性巧例;年龄39一76岁，中位数年龄60.5岁。根据UICC 1997年修订的肺癌分期标准:I期17例，n期10例，111期13例。所有患者均为原发性肺癌，术前均未接受过化疗或放疗等任何治疗。 二、实验方法 1.免疫组织化学（IHC） 采用高明暗、低背景的SABC法（Strept Avidin一biotin Complex）。p14人RF抗体稀释度为1:150，pl6’”K4a和户3抗体均为即用型。标本经40扩L甲醛液固定，常规石蜡包埋，连续切片（厚度3林m）。阴性对照以PBS代替一抗，阳性对照为已知的pl4人RF、p16INK4a和户3阳性的乳腺癌组织片。操作步骤按试剂盒操作说明进行。 2.westem蛋白杂交 随机抽出28例标本进行westem blot检测。分别检测了p14^盯、pl6’NK4“和户3抗体。分别取28个组织标本裂解液，加人等体积样品缓冲液后煮沸smin，SDS一PAGE，12%分离胶，4%变性胶，250V，3h后，硝酸纤维素膜转印1h，脱脂奶粉封闭过夜，一抗（pl4ARF稀释成1:200）孵育lh，TBsT液洗。二抗孵育30而n，ECL磷酸酶染色法显色检验分析。癌旁组织作为自身对照。 3.DNA抽提 DNA抽提按照《分子克隆》（第二版）常规行蛋白酶K消化、酚/抓仿抽提，紫外分光光度计定量，DNA纯度在1 .7一1 .8之间。抽提后DNA保存在一加℃冰箱中备用。 4.LOH检测 两对引物分别扩增D9sl748和D95171位点，它们均位于染色体9夕1的CDKNZA相关位点上。两对引物对同一标本分别进行PCR扩增，取5闪PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，以观察扩增产物的量和特异性。再行8%聚丙烯酞胺凝胶电泳和硝酸银染色，用美国Cha而Imager 5500自动电泳凝胶成像分析系统扫描分析。癌旁组织作为自身对照。 5.纯合性缺失 分别设计Elp和p一ac血引物。两对引物在同一标本中同时进行PcR扩增，取5闪PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，美国Che而Im昭er 5500自动电泳凝胶成像分析系统扫描分析。p一ac血片段作为内参对照，癌旁组织作为自身对照。 6.’p一4ARr Elp突变分析 对Elp行PCR扩增，取2衅PCR产物进行PCR一SSCP检测，结果在美国che而玩age:5500自动电泳凝胶成像分析系统扫描分?