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目前膀胱癌的发病率每年都在上升。研究学者们已经进行了大量的研究来探讨靶向治疗对膀胱癌发展的抑制作用。本研究旨在探讨膀胱癌中长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lncRNA）尿路上皮癌胚抗原1 UCA1（Urothelial carcinoma associated 1）靶向miR-582-5p并通过下调ATG7表达调节癌细胞自噬抑制膀胱癌的发展与耐药性的问题。本文采用定时定量逆转录聚合酶链反应检测m RNA（Messenger RNA）表达水平。通过检测相应蛋白质的表达情况以及荧光素酶报告基因测定和免疫细胞化学测定来确定癌症细胞的发展情况和抑制情况。UCA1在膀胱癌组织和细胞中的表达上调,而短发夹RNA shRNA（Short hairpin RNA）去除UCA1则抑制了细胞的增殖、侵袭、迁移和耐药性。进一步的研究表明,UCA1可以直接与miR-582-5p相互作用,并且miR-582-5p与UCA1之间存在负相关关系。此外,我们发现ATG7是miR-582-5p的靶标,并且可以通过miR-582-5p过表达或降低UCA1来下调ATG7的表达。当研究引入UCA1 shRNA时,膀胱癌细胞自噬受到抑制。此外,体内实验进一步证明了UCA1在膀胱癌中的作用,包括肿瘤生长、侵袭和迁移,并且降低UCA1可以抑制上述活性。这些结果为膀胱癌中新型UCA1相互作用调控网络,即UCA1作用miR-582-5p再作用ATG7表达,从而影响自噬和耐药性提供了证据。我们的研究为膀胱癌的治疗提供了新的依据。第一部分UCA1和miR-582-5p在膀胱癌组织中相互作用的研究目的:为了研究UCA1和miR-582-5p在膀胱癌进展中的作用,分析UCA1和miR-582-5p在膀胱癌组织和癌旁正常组织中的表达水平,并探讨它们之间是否存在直接相互作用。方法:通过定量PCR（qPCR）在人正常细胞SV-HUC-1和膀胱癌衍生细胞HT-1376,T24,J82、5637和EJ中检测到UCA1和miR-582-5p的定量表达,分析癌细胞中UCA1和miR-582-5p的含量;通过定量实时聚合酶链反应（q RT-PCR）测量了UCA1 shRNA转染的T24细胞中miR-582-5p的表达水平;将UCA1的野生型序列（UCA1-wt）或其突变序列（UCA1-mut）亚克隆到p MIR荧光素酶报告基因中,然后与miR-582-5p类对照共转染到T24细胞中,观察miR-582-5p与UCA1的miRNA识别位点之间是否存在联系。结果:与癌旁正常组织相比,UCA1在膀胱癌症组织中高表达,而miR-582-5p则低表达;相同的组织细胞中UCA1和miR-582-5p在膀胱癌组织中呈负相关性;q RT-PCR结果表明UCA1与miR-582-5p相互作用并下调其在T24细胞中的表达;将UCA1的野生型序列（UCA1-wt）或其突变序列（UCA1-mut）亚克隆到p MIR荧光素酶报告基因中,miR-582-5p与UCA1的miRNA识别位点之间存在直接的相互作用。结论:膀胱癌细胞和癌旁正常组织中UCA1和miR-582-5p之间呈负相关性,并且miR-582-5p与UCA1的miRNA识别位点之间存在直接的相互作用。第二部分UCA1和miR-582-5p对膀胱癌细胞生长侵袭的影响目的:探讨UCA1和miR-582-5p在膀胱癌细胞组织中的作用,对膀胱癌细胞生长,侵袭和迁移的影响。方法:人膀胱癌细胞系T24和5637细胞分为四组:对照组,UCA1 shRNA,miR-582-5p抑制剂和shRNA+抑制剂组。用移液管吸头将汇合的细胞单层刮在孔的中间。温育后用DM2500明视野显微镜（德国莱卡,韦茨拉尔）捕获细胞迁移,并通过Image J软件测量迁移距离。T24和5637细胞的侵袭能力使用Transwell侵袭试验进行,通过实验确定UCA1和miR-582-5p对癌细胞生长侵袭的影响。结果:在细胞生长,侵袭和迁移分析中进行了UCA1 shRNA和miR-582-5p抑制剂,结果显示下调UCA1表达能够显着抑制T24和5637细胞的生长,而miR-582-5p抑制剂明显促进T24和5637细胞的生长,下调UCA1表达会显着抑制T24和5637细胞的侵袭,而miR-582-5p抑制剂则明显促进了T24和5637细胞的侵袭,伤口愈合结果显示,下调UCA1表达显着抑制了T24和5637细胞的迁移,而miR-582-5p抑制剂明显促进了T24和5637细胞的迁移;与单独的miR-582-5p抑制剂相比,UCA1 shRNA和miR-582-5p抑制剂的组合表现出减弱的活性。结论:下调UCA1表达和miR-582-5p在膀胱癌细胞组织中能对癌细胞生长,侵袭和迁移起到抑制作用,与单独的miR-582-5p抑制剂相比,UCA1 shRNA和miR-582-5p抑制剂的组合表现出减弱的活性,说明miR-582-5p和UCA1表达互相作用呈负相关关系,能共同对癌细胞的生长,侵袭和迁移起调节作用。第三部分UCA1和miR-582-5p对膀胱癌细胞耐药性和自噬的影响目的:探讨UCA1和miR-582-5p表达情况对膀胱癌细胞耐药性的影响。通过测量微观相关蛋白的比率和自噬底物研究下调UCA1表达对自噬抑制的影响,并且通过UCA1靶向miR-582-5p的相关影响确定靶向自噬基因ATG7。方法:通过测量包括MRP1,LRP,GST和TOPO-II在内的耐药性调节剂来判断UCA1和miR-582-5p表达情况对癌细胞耐药性的影响,蛋白免疫痕迹法用RIPA裂解缓冲液（Beyotime生物技术研究所）裂解细胞。用10%SDS-PAGE分离等量的蛋白质样品,然后转移到PVDF膜上。在TBST中与5%脱脂奶孵育后,检测多药耐药蛋白1（MRP1）,肺耐药相关蛋白（LRP）,谷胱甘肽巯基转移酶（GST）和拓扑异构酶II（TOPOII）的水平。在4℃条件下静置12小时然后,将它们与HRP偶联的二抗在室温下孵育1.5小时。最后,通过电化学发光（ECL）观察印迹,并使用Chemi Doc XRS成像系统进行检测。人膀胱癌细胞系T24和5637细胞分为四组:对照组,UCA1 shRNA,miR-582-5p抑制剂和shRNA+抑制剂组。用移液管吸头将汇合的细胞单层刮在孔的中间,通过定量PCR（qPCR）在人正常细胞SV-HUC-1和膀胱癌衍生细胞T24,5637中检测到UCA1和miR-582-5p的定量表达,同时通过测量微管相关蛋白的比率（自噬标记）和自噬底物水平分析UCA1和miR-582-5p对自噬的影响,miR-582-5p在ATG7-wt转染的细胞中对荧光素酶活性的影响。结果:与对照组相比,UCA1 shRNA组中MRP1,LRP和GST的蛋白质表达显著降低。但是对于TOPO-II,已证明UCA1 shRNA可以增强其表达,而miR-582-5p抑制剂则显示相反的作用。UCA1 shRNA可以下调MRP1,LRP,GST的表达,并上调TOPO-II的表达。UCA1 shRNA转染降低了LC3-II的水平,降低的LC3-II导致LC3-II/LC3-I比值的显着降低,由于p62是自噬降解的底物,UCA1 shRNA增加p62表达证实了下调UCA1表达抑制了细胞自噬;ATG7被UCA1 shRNA下调,而被miR-582-5p抑制剂上调;miR-582-5p在ATG7-wt转染的细胞中降低了荧光素酶活性,但在ATG-mut转染的细胞中没有作用。结论:下调UCA1表达能够降低膀胱癌细胞的耐药性,miR-582-5p抑制剂则能够提高膀胱癌细胞的耐药性。下调UCA1表达可以通过靶向下调miR-582-5p抑制T24和5637细胞的自噬;miR-582-5p直接靶向并抑制ATG7,UCA1通过靶向下调miR-582-5p中自噬基因ATG7调节膀胱癌的耐药性。第四部分自噬对膀胱癌细胞发展和耐药性的影响以及体内抗癌活动验证目的:通过UCA1靶向miR-582-5p抑制ATG7调节自噬能力结合膀胱癌细胞的发展情况和耐药性综合探讨相关性。体外研究已经取到进展之后,在体内研究对上述的结论进行验证。方法:人膀胱癌细胞系T24和5637细胞分为四组:对照组,UCA1 shRNA,miR-582-5p抑制剂和shRNA+抑制剂组。引入了10 n M雷帕霉素（CST,#9904）进行实验,用移液管吸头将汇合的细胞单层刮在孔的中间,通过定量PCR（qPCR）在人正常细胞SV-HUC-1和膀胱癌衍生细胞T24,5637中检测到UCA1和miR-582-5p的定量表达,蛋白免疫痕迹法用RIPA裂解缓冲液（Beyotime生物技术研究所）裂解细胞。用10%SDS-PAGE分离等量的蛋白质样品,然后转移到PVDF膜上（Millipore,Billerica,MA,美国）。在TBST中与5%脱脂奶孵育后,将膜与针对ATG7（ab133528）,LC3A/B（ab62721）,P62（ab155686）,多药耐药蛋白1（MRP1,ab3368）,肺耐药相关蛋白（LRP,ab92544）,GST（ab19256）和拓扑异构酶II（TOPOII,ab52934）在4℃过夜。然后,将它们与HRP偶联的二抗（ab6721）在室温下孵育1.5小时。最后,通过电化学发光（ECL）观察印迹,并使用Chemi Doc XRS成像系统进行检测。取四周大实验白鼠按照动物实验方案将小鼠饲养在标准条件下,并随意喂食常规的无菌食物和水。将总共20只动物平均分为两组。一组皮下注射已被UCA1 shRNA转染的5×106个T24细胞,另一组注射加扰的T24细胞。每5天测量一次肿瘤体积,持续30天。处死所有小鼠后,通过公式长×宽2×0.5计算肿瘤体积,通过定量PCR（qPCR）在人正常细胞SV-HUC-1和膀胱癌衍生细胞T24,5637中检测到UCA1和miR-582-5p的定量表达。结果:UCA1 shRNA负调控自噬,如LC3-II降低和P62以及LC3-II/LC3-I比例升高所证明,而雷帕霉素则起相反的作用;UCA1 shRNA降低了抗药性,这由抗药性相关蛋白（包括MRP1,LRP和GST）的表达降低所证明;同样,雷帕霉素表现出相反的活性;UCA1 shRNA显着降低了细胞生长,细胞侵袭和迁移,而雷帕霉素在这些活性中显示出相反的作用。与体外结果一致,与对照相比,下调UCA1表达显着抑制了肿瘤的生长,下调UCA1表达可下调ATG7的m RNA水平,但上调miR-582-5p的表达水平,免疫组织化学结果显示,下调UCA1表达降低了体内Ki67,PCNA,MMP-9和VEGF的表达,补充了miR-582-5p的抗癌活性结论。结论:UCA1通过靶向miR-582-5p,UCA1表达收到抑制导致miR-582-5p表达增加则会抑制自噬基因ATG7的表达,从而抑制膀胱癌细胞的自噬,并且抑制癌细胞的耐药性,抑制癌细胞的发展。在体外研究和体内研究均符合实验结论,体内研究和体外研究结论一致,补充说明miR-582-5p的抗癌活性,研究具有临床指导意义。