前言 人类基因组中存在着广泛的多态性，最简单的多态形式是发生在基因组中的单个核苷酸的替代，即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。按照1％的频率估计，在人类基因组中每100-300个核苷酸就有一个SNP，因此，整个人类基因组(3.2×10~9bp)中至少有1，100万以上的SNP。单个碱基变异(通常人群分布小于1％)能导致基因功能异常者习惯上被称为突变(Mutation)。SNP在人类遗传学研究中有重要意义，作为遗传标记，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感性分析与药物基因组学的研究中发挥着重要的作用。首先，SNP可以发生在蛋白质编码区，如果是非同义SNP可导致蛋白质合成时氨基酸的“错义”改变。SNP也可发生在基因的蛋白质编码区以外的区域，并通过改变相关基因的调控来影响基因的功能。这些基因组DNA序列的变异，被认为是决定人们的疾病易感性和药物反应的决定因素。其次，SNP还可作为遗传作图研究中的遗传标记，帮助定位和鉴定功能基因。此外，单核苷酸多态性图谱还可以鉴定基因组其他的遗传标记，从而大大简化了全基因组图谱。 氨基肽酶N(Aminopeptidase N，APN)是人类冠状病毒HCoV-229E的细胞受体，在SARS流行期间被认为可能是SARS冠状病毒(SARS-CoV)S蛋白的受体。筛查和发现APN编码基因ANPEP内SNP，对人类冠状病毒感染性疾病的遗传易感性研究非常重要。因此，本文联合应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)及DNA测序技术对ANPEP基因进行了基因变异(突变和多态)筛查。材料与方法 1.标本和基因组DNA提取:采集正常无关个体抗凝外周血。采用常规酚一氯仿抽提法提取基因组DNA。 2.ANPEP基因变异筛查:联合应用PCR一DHPLC技术对A刀PEP基因进行变异筛查并测序确认。 2.1引物设计和PCR扩增:设计A刀PEP基因全部外显子的引物，引物序列位于各个外显子两侧的内含子内，每个扩增片段包含外显子及其两侧部分内含子序列。 2 .2 DHpLC变异筛查:根据wAvE一Make产M4.l软件分析的各个扩增片段的解链温度曲线，确定检测温度，进行样本检测。 2.3测序分析:对于色谱峰型改变的样本，将其PCR扩增产物纯化回收，DNA测序由TaKaRa宝生物(大连)工程有限公司完成。 3.生物信息学分析 利用ExpASy蛋白质组服务器PROSITE数据库(http:刀us.expasy.0喇prosite/)进行APN蛋白基序分析。应用EBI FASTA version3(h丝P二兰匕竺竺竺二ebi.ae.uk/fasta 33/)和NCBI BLAST(http://www.nebi.nlm.nih.goV/BLAST/)进行APN蛋白同源性分析。实验结果 在A刀PEP基因内共检测到21种SNP位点，其中9种位于外显子，12种位于内含子。外显子内的SNP中，6种为非同义SNP(编码氨基酸改变的SNP)，即:Q86R(257A>G)，竹21M(962C>T)，1603M(1809A>G)，S65lL(1952C>T)，s752N(2255G>A)和G764R(2290G>A);3种同义SNp，即:几27P(68 IG>A)，竹95T(2385C>T)和18711(2613A>G)。位于内含子的12种SNP为:IVS7+17G>A，IVS13+41A>C，IVS14一16A>G，IVS17+12C>G，IVS17+44C>T，IVS17一IG>C，IVS19+37T>A，IVS19+75A>G，IVS19+126C>T，IVS19+64A>G，IVS19+137G>T及IVS20+114C>A.。除了Q86R(257A>G)，18711(2613A>G)和 IvS17一IG>C以外，其余18种为新发现的SNP。结论 1.联合应用PCR一DHPLC方法检测到21种A刀PEP基因内SNP，其中16种为新发现的SNP。 2.APNPE基因内SNP的发现，对HCOV一29E等人类冠状病毒感染的遗传易感性研究有重要应用价值。