卵巢癌是女性生殖系统恶性程度最高的肿瘤,也是导致女性死亡的常见的恶性肿瘤。由于卵巢癌早期症状不典型,绝大多数患有卵巢癌的女性发现时已是晚期,肿瘤已扩散至卵巢以外的器官,卵巢癌的5年生存率只有30-40%。尽管手术和化疗方案不断改进,但是大多数患者往往会复发,预后很差。因此,卵巢癌严重威胁着广大女性的身体健康。目前关于卵巢癌的具体发病机制仍然不十分清楚。细胞凋亡是人体内细胞死亡的主要途径之一,其过程受机体的严格调控,调控失衡可引起细胞异常增殖或异常凋亡,导致相关疾病的发生。研究表明,卵巢癌细胞凋亡异常是导致卵巢癌发生发展的重要因素之一。野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(Wild-type p53-induced phosphatase1,Wip1)是1997年发现的一种依赖于p53的原癌基因,它广泛参与调控多种细胞信号通路,对卵巢癌等多种癌症的发生起重要作用。Wip1是一种丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,由PPM1D(Protein phasphatase magnesiumdependent 1 delta)基因编码,主要定位于细胞核内,位于人染色体17q23/q24区域,是PP2C(protein phosatase type 2C)家族中的一员。研究显示Wip1基因与细胞凋亡关系密切。有研究将大鼠暴露于锰环境中造成神经坏死并制成大鼠模型,通过检测发现神经细胞凋亡率明显增加而神经组织及细胞中Wip1的表达量则显著下降。还有研究发现鼻咽癌和肾癌组织中Wip1的表达水平均显著高于其正常组织,沉默Wip1后两种癌细胞的凋亡明显增加。在He La细胞中,沉默Wip1显著降低细胞的生长和增殖,而细胞凋亡增加,p-p38 MAPK、p-p53、p53蛋白的表达也显著增加。因此,Wip1参与了抑制癌细胞凋亡的过程。Wip1表达升高具有抑制细胞凋亡的作用。Wip1在乳腺癌、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤等多种恶性肿瘤组织存在高表达,提示Wip1与恶性肿瘤的关系密切。关于Wip1在卵巢浆液性囊腺癌细胞凋亡中的作用及相关机制的研究目前尚未见报道。因此,本课题通过免疫组织化学染色法、Real-Time PCR、Western blot方法观察Wip1在卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达情况并分析其与临床病理特征的关系,采用小干扰RNA技术、Real-Time PCR、Western blot、Transwell等技术研究Wip1对卵巢癌SKOV3细胞凋亡、侵袭的影响,以阐明Wip1在卵巢浆液性囊腺癌发生发展中的作用及机制。第一部分Wip1在卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达及意义目的:探讨Wip1在卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达情况以及Wip1与卵巢浆液性囊腺癌临床病理特征的关系。方法:选取2012年9月至2014年12月期间河北医科大学第四医院和河北医科大学第一医院妇科手术经病理检查确诊的患者标本80例为研究对象,其中卵巢浆液性囊腺癌50例,交界性卵巢浆液性囊腺瘤20例和因子宫肌瘤行全子宫+双侧附件切除术且病理证实为正常卵巢组织10例。患者年龄45-67岁之间,中位年龄57岁,所有病例术前无化疗及放疗史。按FIGO(2014)标准进行手术病理分期:Ⅰ、Ⅱ期20例,Ⅲ、Ⅳ期30例;组织学分级按照WHO标准:高分化、中分化、低分化分别为21例、7例和22例;淋巴结转移30例,无转移20例。标本取材后部分置于-196℃液氮中速冻,然后转至-80℃冰箱内保存,部分标本用10%甲醛固定,石蜡包埋,行免疫组化染色。通过免疫组化技术,RT-PCR及Western blot对卵巢浆液性囊腺癌组织中的Wip1的表达进行研究,并结合临床病理资料进行分析,以探讨Wip1在卵巢浆液性囊腺癌中的表达情况及其与卵巢浆液性囊腺癌患者临床分期、淋巴结转移及组织病理分化程度的关系。结果:1免疫组化检测Wip1在卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达Wip1表达于卵巢浆液性囊腺癌细胞的胞核及胞浆,在卵巢浆液性囊腺癌组织中阳性表达率为68%,在交界性卵巢浆液性囊腺瘤组织中阳性表达率为60%,在正常卵巢上皮细胞中未见表达,三组比较差异有统计学意义(确切概率法P=0.001)。2 RT-PCR检测Wip1在卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达Wip1m RNA表达在卵巢浆液性囊腺癌(3.1±0.19)高于正常卵巢组织,差异有统计学意义(P<0.01);在交界性卵巢浆液性囊腺瘤(2.5±0.23)较正常卵巢组织增高,差异有统计学意义(P<0.01);在卵巢浆液性囊腺癌中的表达与交界性卵巢浆液性囊腺瘤中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。3 Western blot检测Wip1在卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达Wip1蛋白表达在卵巢浆液性囊腺癌(0.81±0.15)高于正常卵巢组织(0.45±0.22),差异有统计学意义(P<0.05);在交界性卵巢浆液性囊腺瘤(0.82±0.19)高于正常卵巢组织(0.45±0.22),差异有统计学意义(P<0.05);在卵巢浆液性囊腺癌中的表达与交界性卵巢浆液性囊腺瘤中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。4 Wip1表达与卵巢浆液性囊腺癌临床病理特征的关系4.1 Wip1表达与临床病理分期的关系分为Ⅰ、Ⅱ期组及Ⅲ、Ⅳ期组两组,Wip1在两组卵巢浆液性囊腺癌组织中的阳性表达率分别为50%及80%,随着临床期别的升高Wip1的阳性表达率逐渐增加,两组间差异有统计学意义(χ2=4.963,P=0.026)。4.2 Wip1表达与组织学分级的关系Wip1在高分化、中分化、低分化卵巢浆液性囊腺癌组织中阳性表达率分别为52.38%、71.43%及81.82%,三组比较阳性表达率呈增高趋势,差异无统计学意义(确切概率法P=0.118)。4.3 Wip1表达与淋巴结转移的关系Wip1在淋巴结转移组中阳性表达率为83.33%,在无淋巴结转移组中Wip1阳性表达率为45%,两组比较有显著性差异(χ2=8.104,P=0.004)。小结:Wip1在卵巢浆液性囊腺癌组织中高表达,与淋巴结转移、临床分期、组织学分级密切相关。表明Wip1参与了卵巢浆液性囊腺癌的发生、发展过程,为卵巢浆液性囊腺癌发病机制的研究提供了新的理论依据。第二部分Wip1在卵巢癌细胞系中的表达、筛选与沉默目的:探讨Wip1在不同卵巢癌细胞系中的表达情况,筛选出Wip1强表达的细胞系,为进一步研究Wip1在卵巢癌细胞系中的作用机制奠定基础。方法:应用RT-PCR及Western blot检测正常卵巢上皮细胞及卵巢癌细胞株SKOV3、CAOV3、A2780、ES2中Wip1m RNA及蛋白的表达。最终筛选出SKOV3作为实验细胞株。在卵巢癌SKOV3细胞中沉默Wip基因观察其生物学行为的变化。在体外合成Wip1特异性的三对si RNA(Wip1-si RNA-1、Wip1-si RNA-2、Wip1-si RNA-3),一对si RNA阴性对照。Lipofectamine2000介导si RNA转染SKOV3细胞株。实验分组如下:(1)Control组(SKOV3细胞组)(2)N-si RNA组:转染阴性si RNA(3)实验组:转染Wip1-si RNA(1、2、3)者。Western blot检测转染后Wip1蛋白表达的变化,并选择出最有效的Wip1-si RNA-2做后续实验。按照操作步骤每组设置好相应平行孔,将各组细胞依次分别接种至96孔板,培养24小时后进行转染,分别于转染后0小时、24小时、48小时、72小时Western blot检测转染后Wip1蛋白表达的变化;选用si RNA的浓度分别是20nmol/L,40nmol/L,80nmol/L时作用SKOV3细胞,Western blot检测转染后Wip1蛋白表达的变化,筛选出Wip1-si RNA-2作用的最佳时间(48h)及Wip1-si RNA-2作用的最佳浓度(80nmol/L)。结果:1 Real-time PCR检测卵巢正常上皮细胞、SKOV3、CAOV3、A2780、ES2细胞株中Wip1m RNA表达Wip1m RNA表达在SKOV3细胞中(3.85±0.23)明显高于正常上皮细胞,有显著性差异(P<0.01),在CAOV3(1.73±0.46)、A2780(1.89±0.28)、ES2(1.81±0.19)细胞中也均高于卵巢正常上皮细胞,有显著性差异(P<0.05)。2 Western blot检测卵巢正常上皮细胞、SKOV3、CAOV3、A2780、ES2细胞株中Wip1蛋白的表达Wip1蛋白表达在SKOV3(0.73±0.09)、A2780(0.54±0.039)、ES2(1.17±0.08)细胞中明显高于正常上皮细胞(0.15±0.038),有显著性差异(P<0.01),在CAOV3(0.25±0.045)细胞中也高于卵巢正常上皮细胞,有显著性差异(P<0.05)。通过检测SKOV3、CAOV3、AZ780、ES2细胞中Wip1的表达,发现Wip1在SKOV3细胞中m RNA与蛋白的表达明显高于其他三种细胞,因此后续采用SKOV3细胞进一步研究Wip1与卵巢浆液性囊腺癌的关系。3沉默Wip1对SKOV3细胞的影响转染si RNA-2的SKOV3细胞中Wip1蛋白表达最少,Wip1-si RNA-2转染SKOV3细胞后,Wip1的表达随着其浓度的增加呈减少趋势,在浓度为80nmol/L达到最低值;而作用时间为48小时Wip1蛋白表达也达到最低。提示,Wip1-si RNA转染SKOV3细胞在特定浓度和作用时间时影响最大(P<0.01)。小结:在SKOV3、CAOV3、A2780、ES2细胞中均发现Wip1有过表达现象,其在SKOV3细胞中表达水平最高,Wip1-si RNA转染SKOV3细胞在特定浓度和作用时间时沉默效果最好,为进一步阐述其分子机制提供了理论支持。第三部分沉默Wip1对卵巢癌细胞凋亡的影响目的:探讨沉默Wip1对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的作用及相关的分子机制。方法:AnnexinⅤ/PI染色检测Control组、N-si RNA组、Wip1-si RNA(2)(Wip1-si RNA)组中SKOV3细胞凋亡率。RT-PCR检测Control组、N-si RNA组、Wip1-si RNA组中Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、P53、Bcl-2m RNA的表达。Western blot检测Control组、N-si RNA组、Wip1-si RNA组中Bcl-2、Bax、P53、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、p38 MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白的表达。为明确p38 MAPK信号通路是否参与了SKOV3细胞凋亡,加入P38 MAPK特异性抑制剂SB203580后检测p-p38及p38的表达情况。结果:1流式细胞技术检测沉默Wip1对SKOV3细胞凋亡率的影响AnnexinⅤ/PI染色结果表明,与Control组相比,Wip1-si RNA组沉默Wip1后SKOV3细胞凋亡率显著增加(P<0.01);与N-si RNA组相比,Wip1-si RNA组SKOV3细胞凋亡率也显著增加(P<0.01)。此外,N-si RNA组与Control组相比SKOV3细胞的凋亡率无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。2 RT-PCR检测沉默Wip1对SKOV3细胞凋亡相关基因表达的影响为研究沉默Wip1后SKOV3细胞凋亡发生情况,对凋亡相关基因Bax、Caspase-3、cleaved Caspase-3、P53、Bcl-2表达情况进行检测,沉默Wip1后,SKOV3细胞中P53m RNA(2.5±0.034)较Control组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);Bax/Bcl-2及cleaved Caspase-3/Caspase-3比值较Control组则明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结果提示:沉默Wip1后能够促进SKOV3细胞的凋亡。3 Western blot检测沉默Wip1对SKOV3细胞凋亡相关蛋白表达的影响为研究沉默Wip1后SKOV3细胞凋亡发生情况,对凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、cleaved Caspase-3、P53、Bcl-2表达情况进行检测,沉默Wip1后,SKOV3细胞中P53蛋白(1.02±0.039)较Control组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);Bax/Bcl-2及cleaved Caspase-3/Caspase-3比值较Control组则明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结果提示:沉默Wip1后能够促进SKOV3细胞的凋亡。4沉默Wip1通过p38 MAPK信号通路诱导SKOV3细胞的凋亡沉默Wip1后检测SKOV3细胞中ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、P38、P-P38的蛋白表达,P-P38的蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),提示P-P38可能参与了SKOV3细胞的凋亡。为明确p38 MAPK信号通路是否参与了SKOV3细胞的凋亡,加入P38MAPK的特异性抑制剂SB203580,p-p38的蛋白表达则明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。小结:沉默Wip1能够促进人卵巢癌SKOV3细胞凋亡可能是通过上调P53、cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bax/Bcl-2比率,活化P38MAPK信号通路而实现的。第四部分沉默Wip1对卵巢癌细胞侵袭的影响目的:探讨Wip1与卵巢癌细胞SKOV3侵袭力的关系,揭示Wip1对SKOV3细胞的侵袭和迁移等恶性生物学行为的影响。方法:划痕实验、Transwell小室法测定Wip1沉默后SKOV3细胞体外侵袭能力。RT-PCR检测SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2m RNA的表达;Western blot检测SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表达结果:1划痕实验测定Wip1-si RNA沉默Wip1基因对SKOV3细胞体外侵袭能力的影响Wip1-si RNA组细胞迁移距离(30.333±3.670)明显短于Control组(59.333±7.685),差异有统计学意义(P<0.01);N-si RNA组和Control组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2 Transwell小室法测定Wip1-si RNA沉默Wip1基因对SKOV3细胞体外侵袭能力的影响Wip1-si RNA转染SKOV3细胞后使其侵袭基底膜能力受到显著抑制,SKOV3细胞侵袭到Transwell小室滤膜下细胞数Wip1-si RNA组为(17.167±1.835),显著低于Control组(31.167±3.43)和N-si RNA组(29.667±4.179),差异有统计学意义(P<0.01);N-si RNA组和Control组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3 RT-PCR检测沉默Wip1后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2m RNA的表达Wip1-si RNA组MMP-2m RNA(0.51±0.013)和MMP-9 m RNA(0.4±0.028)的表达较Control组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);Wip1-si RNA组TIMP-1m RNA(0.98±0.015)和TIMP-2 m RNA(0.97±0.029)的表达较Control组无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。4 Western blot检测沉默Wip1后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表达Wip1-si RNA组MMP-2蛋白(0.43±0.049)和MMP-9蛋白(0.31±0.052)的表达较Control组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);Wip1-si RNA组TIMP-1蛋白(0.9±0.033)和TIMP-2蛋白(0.8±0.039)的表达较Control组无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。小结:沉默Wip1能够抑制人卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力,可能是通过抑制MMP-2、MMP-9的表达实现的。