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感受激酶GacS(global activator sensor kinase)和反应调控因子GacA(global antibiotic and cyanide control)是双元调控系统（two-component regulatory system）的两个组分。GacS/GacA系统调控胞外生防因子和致病因子的合成，是抗生素等次级代谢产物合成所必需的。在许多革兰氏阴性菌中，保守的双组分调控系统GacS/GacA对细菌胞外产物的合成与分泌具有决定性的控制作用。如在一些植物、动物和人的病原菌中，当gacS或者gacA基因发生突变时，突变株的多种胞外产物分泌受到不同程度的抑制，对植物、动物和人的致病性也显著降低。目前对GacS、GacA蛋白的研究主要是对gacS、gacA基因突变，分析突变对细胞胞外产物等各个方面的影响。尚无对GacS、GacA蛋白的直接获得及研究。因此，gacS、gacA的克隆、表达与纯化及深入的研究是一个极富意义的研究领域。本课题对双元调控系统的gacS和gacA进行克隆、蛋白表达与纯化研究。以假单胞菌M18全基因组为模板，pET28b（+）为载体，克隆gacS、gacA基因。将重组质粒pET/gacA经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达，GacA蛋白得到可溶性表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化，蛋白纯度约为95%，MALDI-TOF鉴定证明纯化的蛋白为假单胞菌M18GacA蛋白。对GacA进行热稳定性分析，GacA蛋白不耐高温，40℃10min即变性沉淀。GacA结合在NTA-Ni柱上，M18菌体蛋白通过NTA-Ni-GacA柱，截留的肽段有几丁质酶、50S核糖体蛋白L25、热休克蛋白90、顺乌头酸水合酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、过氧化物还原酶亚基C、延伸因子G。这七种蛋白可能与GacA有相互作用，但是该实验只是初步探索，需要进一步做大量的实验研究来进行验证。UCLA-DOE预测gacS基因中含有38个稀有密码子，所以在大肠杆菌BL21(DE3)中不能被诱导表达，将重组质粒pET/gacS经热激转化至大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP中,IPTG诱导表达，膜蛋白GacS以包涵体形式表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化，蛋白纯度约为90%。GacS用TMHMM2.0预测蛋白跨膜结构，氨基酸11-33及168-187为GacS的跨膜结构。