【摘 要】
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噬菌体裂解酶属于溶菌酶的一类,可以水解细菌细胞壁肽聚糖,从而使宿主裂解死亡。噬菌体裂解酶具有特异、高效、安全等特点,有望替代抗生素使用以缓解日益突出的细菌耐药性问题。高温噬菌体裂解酶不仅在常温下具有杀菌作用,还具有较高的热稳定性,这为它的制剂化提供了前提条件,为抗生素替代技术提供了一个新的研究方向。本文以前期构建的大肠杆菌基因工程菌pET28a-TSPphg/BL21(DE3)和pET28a-MM
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噬菌体裂解酶属于溶菌酶的一类,可以水解细菌细胞壁肽聚糖,从而使宿主裂解死亡。噬菌体裂解酶具有特异、高效、安全等特点,有望替代抗生素使用以缓解日益突出的细菌耐药性问题。高温噬菌体裂解酶不仅在常温下具有杀菌作用,还具有较高的热稳定性,这为它的制剂化提供了前提条件,为抗生素替代技术提供了一个新的研究方向。本文以前期构建的大肠杆菌基因工程菌pET28a-TSPphg/BL21(DE3)和pET28a-MMPphg/Rosetta(DE3)为研究对象,建立高密度发酵工艺体系;通过高压匀浆方法进行菌体破碎,得到高浓度的裂解酶TSPphg和MMPphg,使用扫描电镜(SEM)观察其裂菌活性;筛选载体通过沸腾式干燥进行粗酶制剂化,通过平板计数方法检测酶制剂产品活性并进行活性跟踪;最后将复合裂解酶制剂添加到白羽肉鸡日粮中,评估噬菌体裂解酶作为无抗饲料添加剂对白羽肉鸡生长性能、免疫器官指数和主要抗氧化酶活指标的影响;取盲肠进行宏基因组测序,通过生物信息学方法进行盲肠细菌多样性分析,以评估噬菌体裂解酶作为无抗饲料添加剂相比金霉素对白羽肉鸡盲肠主要功能菌群的影响。为了建立裂解酶TSPphg和MMPphg的高密度发酵体系,本研究以基因工程菌pET28a-TSPphg/BL21(DE3)进行发酵条件摸索,结果表明:当OD600=1.2-1.5时,1.25 mg/mL乳糖诱导5 h为最佳诱导条件,在20 L的发酵罐中按3%接种量,发酵25 h生物量可达OD600=58。破碎试验表明,通过高压匀浆方法释放TSPphg为4.012 mg/mL。为了得到高浓度的裂解酶,利用前期工艺条件将基因工程菌pET28a-TSPphg/BL21(DE3)和pET28a-MMPphg/Rosetta(DE3)扩大至200 L发酵罐中以150 L体积高密度发酵,结果表明:TSPphg浓度为3.80mg/mL,MMPphg浓度为3.02 mg/mL;SEM结果展示了 TSPphg对大肠杆菌O157的裂解效果,MMPphg对鼠伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50094)的裂解效果而验证其杀菌功能。选择硅藻土作为载体制备裂解酶复合粉剂,测得裂解酶制剂含水量为9%-12%,低温(20℃)干燥保存360 d活性跟踪可存余80.5%。为了评估裂解酶作为无抗饲料添加剂对动物肠道菌群的影响,本研究以白羽肉鸡进行体内试验评估。结果表明,白羽肉鸡日粮中添加裂解酶粉剂28 d后,与空白对照比较,裂解酶添加量为200 mg/kg时,料肉比显著降低(P<0.05);血浆SOD、GSH-Px活力显著提高(P<0.05);肝脏GSH-Px活力显著提高(P<0.05);血浆和肝脏CAT活力均极显著提高(P<0.01)。测序后在属(genus)水平上与空白组(CHE)的主要核心功能菌群比较发现,鸡盲肠中有超过1/2的益生菌丰度升高,其中艾克曼菌属(Akkermansia)、Barnesiella、肠球菌属(Enterococcus)、Flavonifractor、食物谷菌属(Victivallaceae)的绝对丰度极显著升高(P<0.01),双歧杆菌属(Bifidobacterium)、粪杆菌属(Faecalibacterium)的绝对丰度显著升高(P<0.05)。常见致病菌中的弯曲杆菌属(Campylobacter)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、螺杆菌属(Helicobacte、伤寒真杆菌属(Eubacterium hallii group)的绝对丰度表现为极显著下降(P<0.01)。综上所述,噬菌体裂解酶TSPphg和MMPphg在实现高密度发酵的基础上,作为饲料添加剂可有效改善白羽肉鸡生长性能及主要抗氧化酶活指标,对改善白羽肉鸡肠道功能菌群平衡,维持肠道健康有一定功效,可为后续无抗饲料的开发提供一个新的思路。
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