论文部分内容阅读
目的:利用串联红绿荧光蛋白报告基因标记的溶酶体膜蛋白来检测前列腺癌细胞溶酶体的变化,构建靶向溶酶体膜通透化(LMP)的筛选模型,为后续靶向溶酶体膜通透化的药物筛选奠定基础。方法:1.设计构建串联红绿荧光报告基因标记溶酶体膜蛋白(Lamp2C)的真核表达载体pLamp2C-mRFP-EGFP、pLamp2C-EGFP-mRFP、pmRFP-EGFP-Lamp2C、pEGFP-mRFP-Lamp2C;2.用不同浓度的鞘氨醇处理细胞,利用流式细胞术和MTT观察鞘氨醇对细胞凋亡和坏死的影响;3.荧光显微镜观察构建的质粒转染入PC3细胞的表达情况;用LysoTracker Blue孵育标记转染后的PC3细胞,共聚焦显微镜下观察转染的质粒与溶酶体共定位情况;用鞘氨醇处理转染后的PC3细胞,共聚焦显微镜观察加入鞘氨醇前后红绿荧光的变化。利用Image J软件定量分析共定位情况和红绿荧光变化。结果:1.pLamp2C-mRFP-EGFP、pLamp2C-EGFP-mRFP、pmRFP-EGFP-Lamp2C、pEGFP-mRFP-Lamp2C质粒构建成功;2.鞘氨醇能诱导细胞凋亡;3.四种质粒瞬时转染至PC3细胞,pLamp2C-mRFP-EGFP转染效果最好,mRFP及EGFP均正常表达;pLamp2C-mRFP-EGFP与溶酶体共定位结果:皮尔森相关系数(Pearson’s correlation coefficient)为0.8362±0.0518;经鞘氨醇处理前后,PC3细胞绿色荧光强度(0.1190±0.0223)比(0.0639±0.0156),明显减弱(t=14.66,P﹤0.05),差异有统计学意义,红色荧光强度(0.1049±0.0101)比(0.1038±0.0109),无明显变化(t=1.136,P﹥0.05),差异无统计学意义。结论:成功转染构建的pLamp2C-mRFP-EGFP至PC3细胞溶酶体,经鞘氨醇处理后绿色荧光明显减弱,红色荧光无明显变化,指示PC3细胞溶酶体膜通透化。