论文部分内容阅读
聚乙烯醇（polyvinyl alcohol）简称PVA,是一种高分子聚合物,它具有良好的水溶性,并且可以通过生物法来进行降解。由于它的可生物降解性,近些年来这种潜力受到了广泛关注。PVA具有热稳定性、成膜性、乳化性、高粘度等许多优良的特性,我国每年都要消耗大量的PVA。巨大的使用量下,PVA废水的排放带来了环境问题。尽管PVA可生物降解,但存在很大的局限性,其生物降解速度慢,降解效率低。因此本论文从PVA微生物法降解和PVA酶法降解这两方面研究PVA的生物降解,提高PVA生物降解速率。主要研究结果如下:（1）在无锡太平洋集团富含PVA的地点取样,富集、传代驯化后筛选到一个可以在48 h内完全降解1 g·L-1 PVA的混菌体系BQ-2,从中分离纯化出一株PVA降解能力最强的单菌F2,经鉴定F2属于鞘脂单胞菌属（Sphingopyxis sp.）。对培养基中酵母粉添加量进行优化,进一步提高F2降解PVA的性能。F2在添加1 g·L-1酵母粉的培养基中,生长状况良好,培养120 h,对1 g·L-1 PVA的降解率达到90%以上。相同条件下,相比在无机氮培养基中约50%的降解率,F2的降解能力提高了80%以上。在F2的细胞破碎上清液中检测到了聚乙烯醇脱氢酶（PVADH）酶活和氧化型PVA水解酶（OPH）酶活。（2）以F2为出发菌株,进行等离子诱变,以获得PVA降解能力更强的菌株。基于致死率,确定最佳诱变时间为12 s。通过高通量筛选方法对经过诱变处理后的菌株进行筛选,来获得PVA降解能力提高的正向突变株。经过摇瓶复筛,72 h后,得到一株PVA降解率比出发菌株F2提高了53%的突变株SM2。经过遗传稳定性分析发现,SM2连续传10代,每代PVA降解率的变化幅度均在10%以内,表明诱变菌株SM2具有良好的遗传稳定性。（3）以F2的基因组DNA为pvadh和oph的基因来源,分别实现PVADH和OPH高效表达。将密码子优化后的pvadh基因片段插入表达载体pPIC9K的多克隆位点,得到pPIC9K/pvadh,经Sal I线性化后电转化工程菌P.pastoris GS115,选择在G418浓度为3 mg·mL-1的YPD平板上筛选到的P.pastoris GS115/pPIC9K/pvadh进行摇瓶发酵,经甲醇诱导120 h,PVADH酶活最高达到约523 U·mL-1;将oph基因片段插入表达载体pET-20b（+）的多克隆位点,得到pET-20b（+）/oph,转化工程菌E.coli BL21（DE3）,将重组菌株E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）/oph进行摇瓶发酵,诱导120 h,OPH酶活最高达到约20.6 U·mL-1。（4）探究PVA的酶法生物降解,对PVADH和OPH双酶降解PVA的工艺条件进行优化。研究了PVADH酶量、OPH酶量、反应温度、pH、Ca2+和PVA浓度这6个单因素对PVA降解率的影响。通过单因素实验,选择三个显著的因素,即PVADH酶量、pH和反应温度进行最陡爬坡实验、Box-Behnken实验以及响应面分析,最终得到了优化的PVA双酶降解工艺条件:PVADH 123 U·m L-1、pH 7.7、反应温度41℃、OPH 12 U·m L-1、PVA 1 g·L-1、Ca2+浓度1 mmol·L-1、PQQ浓度6μmol·L-1。在优化条件下,反应进行1 h,PVA降解率为34.07%;反应4 h,PVA降解率达到95%以上。