论文部分内容阅读
目的:急性缺血性卒中仍是神经内科常见的导致死亡和残障的疾病。近年来随着急性期静脉溶栓和机械取栓等血管再通治疗的开展，已明显改善了预后，然而同时血管再通治疗后可能使脑组织损伤和神经功能障碍进一步加剧，即缺血再灌注(I/R)损伤。研究证明给予动物短暂、非致死性的缺血，即缺血适应可缓解I/R引起的脑损伤。缺血后处理是于再灌注开始以后对动脉进行短暂、多次的阻断/开放过程。传统的缺血处理是对靶器官动脉直接进行缺血再灌注处理，难以在临床中施行，而远程缺血后处理是指在心脏、脑等重要脏器发生缺血损伤后，对远隔器官动脉（如下肢）进行多次短时间、非致命性的血流阻断/开放，触发机体内源性保护机制，以减轻重要脏器的缺血损伤。近年来研究发现肢体远程缺血后处理（RIPostC）能减轻脑缺血/再灌注损伤，但确切机制尚不明确。 血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的构成包括脑微血管内皮细胞、血管周细胞、基底膜和星形胶质细胞终足，是脑实质和血液循环之间的物理性及化学性屏障，对保持中枢神经系统内环境稳定起到十分重要的作用。脑微血管内皮细胞间的紧密连接是BBB的重要结构功能组件，填充在细胞间隙，构成血液与神经组织物质交换的屏障。紧密连接主要由跨膜蛋白和胞浆脚手架蛋白组成，其中claudin-5、occludin是两种重要的跨膜蛋白。在脑I/R损伤中，BBB破坏对产生脑水肿和进一步加重炎症级联反应起关键性作用，并与脑梗死后出血性转化有关。多项动物实验研究证实RIPostC能减轻脑I/R损伤造成的BBB破坏。在脑I/R损伤中，PI3K/Akt通路的活化参与调控神经炎症、神经元凋亡与自噬，是促进神经细胞存活的重要信号转导途径，有研究证明该信号通路可能参与RIPostC的神经保护作用。Fibulin-5是一种细胞外基质糖蛋白，能增强血管内皮细胞与细胞外基质间的粘附，可能是一种促进血管内皮稳定的因子，促进血脑屏障结构的稳定，在脑I/R损伤中发挥神经保护作用。目前国内外关于Fibulin-5在RIPostC中的作用尚无报道，为了探讨fibulin-5在RIPostC中是否参与对血脑屏障的保护作用以及相关的信号调控机制，本研究中首先使用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻断模型，缺血2h给予再灌注，利用病理学、分子生物学等方法检测fibulin-5表达、BBB渗漏、梗死体积、神经行为学评分、claudin-5及occludin表达和Akt通路磷酸化，证实fibulin-5在RIPostC中对血脑屏障的保护作用，研究RIPostC对脑I/R损伤保护的分子机制，为缺血性脑卒中的脑保护治疗提供研究基础。 方法: 1.实验动物分组:健康雄性SD大鼠，SPF级，体重250g～280g，随机分组:术前组;假手术组;缺血再灌注组;缺血再灌注+远程缺血后处理组，根据实验设计在不同时点处死动物并取材。 2.大鼠MCAO模型制作:根据改进的Zea Longa线栓法进行MCAO模型制作。腹腔内注射10％水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉动物后剪去颈部毛，碘伏常规消毒。沿颈部中线纵行切口，从颌下腺体内侧切开，剪开筋膜，找到右方的胸锁乳突肌。顺胸锁乳突肌边缘继续分离，在肌肉的缝隙间暴露出颈动脉鞘，小心游离出右侧颈总动脉和迷走神经。谨慎地将颈内动脉和颈外动脉剥离出来。用丝线将颈外动脉远心端结扎，用动脉夹夹在颈外动脉起始段及颈总动脉上，在颈外动脉上用眼科剪刀剪出斜行小口，插入准备好（用记号笔标记距头端18mm处，浸泡于肝素钠盐水）的线栓，调整角度经颈内动脉插入，感到有一定阻力时不再深入，插入约18～19mm。缺血2h后将线栓轻轻拔除，缝合皮下和皮肤。假手术组只暴露动脉，线栓不入颅。 3.远程缺血后处理:在阻断右侧大脑中动脉血流后在大鼠双侧腹股沟处做长约1cm的切口，钝性分离双侧股动脉，拔出线栓再灌注的同时用动脉夹将双侧股动脉钳夹10min，再通10min，共3次重复后缝合皮肤。 4.侧脑室内注射:腹腔内注射10％水合氯醛(3.5ml/kg)实施麻醉。俯卧位固定鼠嘴，调整立体定向器耳杆并旋紧，消毒铺巾，沿正中线切开头皮显露颅骨，参考Paxions-Waston大鼠脑部图谱及相关文献记载，取坐标:前囟后方1mm，中线右侧1.5mm，骨表面向下3.8mm。用牙钻在颅骨表面钻一直径约1mm小孔，钻至硬膜后用注射器针头刺破硬膜。将微量注射器刺入右侧侧脑室，使用微量注射泵以0.5μ l/min注入转染试剂，注射量为5μ l。注射完成后保持10min，再慢慢的拔出微量注射器，然后缝合头皮。侧脑室内注射siRNA抑制fibulin-5表达，注射LY294002和Wortmannin抑制PI3K/Akt通路。 5.根据Garcia大鼠神经行为学评分标准进行评分。 6.采用干湿重法测定缺血侧半球脑组织含水量。 7.利用伊文思兰渗透法检测BBB渗漏。 8.采用TTC染色法测量梗死体积。 9.Western Blot检测fibulin-5、claudin-5、occludin、p-Akt1Thr308、p-Akt1Ser473和总Akt的表达 10.Real-time PCR测定fibulin-5 mRNA 11.免疫荧光染色观察claudin-5、occludin间隙形成 12.统计学分析 数据统计使用SPSS17.0软件，作图使用GraphPad Prism(Version6.01)。全部结果以(x)±SD表示。各组样本间均数比较使用单因素方差分析(One-wayANOVA)，均数间多重比较使用Bonferroni检验，P＜0.05认为差异具有显著性意义。 结果: 1.RIPostC对MCAO大鼠的神经保护作用 RIPostC可以改善MCAO大鼠神经行为学评分，减少脑梗死体积，减轻脑水肿，减少BBB渗漏。 2.RIPostC对MCAO大鼠脑缺血半暗带fibulin-5表达的影响 Western Blot显示各组fibulin-5相对表达量于再灌注6h升高;再灌注24 h、72h升高更为明显。再灌注24 h及72h I/R+RIPostC组fibulin-5相对表达量明显高于I/R组。 Real-time PCR结果显示，各组fibulin-5 mRNA相对表达量于再灌注6h开始增加，再灌注24h达到峰值，再灌注72h有所下降。再灌注24 h及72h I/R+RIPostC组fibulin-5 mRNA相对表达量明显高于I/R组。 3.Fibulin-5 siRNA转染对fibulin-5表达的影响 Western Blot和Real-time PCR结果均显示脑室注射fibulin-5 siRNA可使fibulin-5表达水平下降，沉默效率约为75％(mRNA)，抑制了RIPostC产生的fibulin-5表达上调。 4.抑制fibulin-5表达对RIPostC产生的脑保护作用的影响 侧脑室注射fibulin-5 siRNA后大鼠神经行学评分降低，TTC染色显示梗死体积增大，限制了RIPostC产生的脑保护作用。 5.抑制fibulin-5表达对脑水肿和BBB渗漏的影响 侧脑室注射fibulin-5 siRNA后，再灌注24h及72h，RIPostC引起的脑水含量降低和EB渗出量降低被抑制。 6.抑制fibulin-5表达对claudin-5、occludin表达的影响 RIPostC使再灌注24h脑claudin-5、occludin表达增加。侧脑室内注射fibulin-5siRNA抑制了RIPostC引起的claudin-5、occludin表达上调。 7.免疫荧光检测claudin-5、occludin细胞间裂隙形成 RIPostC使claudin-5、occludin表达增加，细胞间裂隙减少;侧脑室注射siRNA可使细胞间裂隙明显增多。 8.抑制PI3K/Akt通路对fibulin-5表达的影响 Western Blot证实RIPostC可增加Akt1 Thr308和Akt1 Ser473的磷酸化，激活PI3K/Akt通路。使用侧脑室注射LY294002和Wortmannin可抑制RIPostC产生的fibulin-5表达上调。 结论:RIPostC可以明显改善MCAO大鼠的神经行为学评分，缩小脑梗死体积，降低BBB渗漏。脑I/R损伤后fibulin-5表达上调，本研究首次报道了RIPostC使fibulin-5表达进一步升高，fibulin-5表达上调可能参与RIPostC对抗脑I/R损伤的神经保护作用。 在RIPostC中fibulin-5表达与claudin-5、 occludin表达相关，RIPostC可影响fibulin-5表达进而调节TJs蛋白的表达，在脑I/R损伤中保护BBB。上调fibulin-5表达可能是RIPostC保护BBB的一种机制。 RIPostC可引起PI3K/Akt通路磷酸化。通过侧脑室注射PI3K/Akt通路抑制剂LY294002和Wortmannin，我们首次报道了在RIPostC中fibulin-5表达上调受到PI3K/Akt通路调控，fibulin-5可能是PI3K/Akt通路的下游靶分子之一。