论文部分内容阅读
目的：通过体内外实验研究片仔癀对大肠癌多药耐药的逆转作用,并探讨其机制。方法：1、细胞实验：通过MTT法检测细胞活力验证HCT-8/5-FU细胞的耐药性和研究片仔癀的逆转作用；采用MTT检测细胞活力,显微镜观察细胞形态学改变,集落形成实验检测细胞存活能力,流式细胞仪检测细胞周期等研究片仔癀对HCT-8/5-FU细胞增殖的影响；通过Hoechst染色观察细胞凋亡情况和比色法检测Caspase-9、Caspase-3的活化研究片仔癀对HCT-8/5-FU细胞凋亡的影响；采用Transwell检测片仔癀对HCT-8/5-FU细胞迁移和侵袭的影响；通过流式细胞仪和HPLC分别检测罗丹明和5-FU在细胞内的蓄积探讨片仔癀对HCT-8/5-FU细胞药物外排功能的影响。采用RT-PCR和Western-Blot检测片仔癀对Bcl-2、Bax、CyclinD1、CDK4及ABCG2在mRNA和蛋白水平表达的影响。2、动物实验：BABL-c裸鼠腋下接种HCT-8/5-FU细胞建立耐药皮下移植瘤模型,并分别用5-FU (20mg/kg)和片仔癀(234mg/kg)干预,通过瘤体体积和重量评价片仔癀对HCT-8/5-FU细胞移植瘤生长的影响；通过TUNEL法检测片仔癀对移植瘤细胞凋亡的影响,免疫组化(IHC)检测Ki-67表达研究片仔癀对移植瘤细胞增殖的影响；采用RT-PCR和Western-Blot技术检测片仔癀对Bcl-2、Bax、CyclinD1、CDK4及ABCG2在mRNA和蛋白水平的表达的影响。3、miRNA检测：通过Q-PCR检测片仔癀对HCT-8/5-FU细胞miRNAs (miR-200a, miR-200c, miR-582, miR-22)表达的影响。结果：1、细胞实验：(1) HCT-8/5-FU细胞经5-FU和ADM干预48h后的IC50均显著大于HCT-8细胞,耐药指数(RI)分别为>34.59和4.22(RI>1.5即认为对该药耐药),片仔癀干预后二者IC50未见显著差异,耐药指数(RI)小于1.5；(2)片仔癀分别联合5-FU和ADM干预可显著降低二者IC50,其逆转倍数(RE)分别为>1.96和1.51(RE>1.5即认为具有逆转作用)；(3)片仔癀干预抑制HCT-8/5-FU细胞增殖：MTT检测显示片仔癀干预能够显著降低HCT-8/5-FU细胞活力,并呈现一定的剂量依赖和时间依赖；细胞形态学观察和集落形成实验均表明片仔癀干预能够显著降低细胞密度和减少集落形成数量；细胞周期检测提示片仔癀干预能够显著增加G0/1期细胞的比例,降低S期细胞的比例；(4)片仔癀干预诱导HCT-8/5-FU细胞凋亡：Hoechst染色显示随片仔癀浓度增加,细胞核出现高染或核固缩变亮的细胞数增加；比色法检测Caspase-9和Caspase-3活化结果显示片仔癀干预能够显著增加Caspase-9和Caspase-3的活化水平,且呈现一定的剂量依赖；(5)片仔癀干预能够显著增加罗丹明和5-FU在HCT-8/5-FU细胞内的蓄积；(6)片仔癀干预显著降低HCT-8/5-FU细胞迁移和侵袭能力；(7)RT-PCR和Western-Blot检测提示片仔癀能够显著下调抗凋亡蛋白Bcl-2、细胞周期调控蛋白CyclinD1和CDK4、转运蛋白ABCG2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达。2、动物实验：(1) HCT-8/5-FU细胞移植瘤的体积和重量检测结果提示片仔癀干预能够显著抑制移植瘤生长,而5-FU对移植瘤生长未见影响；(2) TUNEL检测细胞凋亡结果提示：片仔癀干预能够显著促进移植瘤细胞凋亡,而5-FU对细胞凋亡未见影响；(3)免疫组化检测Ki-67表达结果提示：片仔癀干预能够显著抑制移植瘤细胞增殖,而5-FU干预对移植瘤细胞增殖未见影响；(4) RT-PCR和Western-bloy检测提示片仔癀能够显著下调抗凋亡蛋白Bcl-2、细胞周期调控蛋白CyclinD1和CDK4、转运蛋白ABCG2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达；而5-FU干预对上述基因表达未见影响。3、miRNAs表达检测结果提示：片仔癀干预能够显著上调miR-200a, miR-200c, miR-582, miR-22的表达。结论：体内外实验证实片仔癀能够逆转大肠癌多药耐药,具有显著抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞药物外排功能和细胞迁移侵袭能力的作用,且通过调控Bcl-2、 CyclinD1、CDK4、Bax、ABCG2多个基因和多个miRNA(miR-200a, miR-200c, miR-582, miR-22)的表达可能是其重要机制。