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目的制备一种新型的复合缓释制剂和移植材料—两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜,进行形态学观察,初步研究其体内外缓释性能及体外抑菌作用,为该缓释药膜的研制及临床应用提供实验基础。本实验分为四部分:第一部分两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜的制备及形态学观察第二部分高效液相色谱法检测两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜体外缓释作用第三部分两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜体外抗真菌药敏测试第四部分两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜移植后兔眼房水药物浓度测定方法实验一:精密称取1000 mg两性霉素B脂质体冻干粉(含10 mg两性霉素B)溶于2.5 ml纤维蛋白胶催化液中,与2.5 ml主体液混合后,均匀喷涂于羊膜基底面上,制成浓度2 mg/ml,厚度约0.2mm～0.3 mm的两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜(浓度以两性霉素B计),冷冻干燥。光镜及扫描电镜进行形态学观察。实验二:取制备好的两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜置于无菌试管中,加入5 ml生理盐水,置于37℃恒温箱中震荡,每24 h置换一次生理盐水,连续10 d,换出的生理盐水浸出液置于-40℃保存。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定各天生理盐水浸出液中两性霉素B含量。实验三:将茄病镰刀菌及烟曲霉菌分别接种在新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂培养基和察氏培养基斜面上,连续转接2次培养,选择生长良好的菌落转种,25～28℃培养7天,制备菌悬液。采用肉汤微量稀释法,取一次性无菌96孔培养板,第1-4排1-11孔加入100μl用RPMI1640培养基倍比稀释的2倍于待试抗真菌药物浓度的药液,5-8排1-10孔分别加入100μl每天置换的药膜浸出液,每排最后1孔作为不加药的生长对照孔。然后将制备好的真菌接种物加到试验微孔板中,每孔100μl。培养板置35℃孵育约46～50 h,判读MIC结果。实验四:健康新西兰大白兔15只,随机分为3组,每组5只10眼,右眼为实验眼,左眼为对照眼,实验眼予以直径20 mm两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜片缝合固定于角巩膜缘,对照眼滴入配制的浓度2 mg/ml两性霉素B脂质体眼液,1天3次。分别于术后和滴眼后1、2、3、4、5天双眼同一时间点抽取兔眼房水100μl,各组每个时间点取1只兔子6只眼。高效液相色谱法检测实验眼和对照眼房水中两性霉素B浓度。结果试验一:大体形态:两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜为淡黄色,平整如纸样半透明薄膜,在平衡盐溶液中复水后仍能保持较好的韧性及抗拉性,药物-纤维蛋白胶与羊膜贴合紧密。HE染色:药物-纤维蛋白胶与羊膜基底面贴合紧密,药膜平整无皱缩,羊膜上皮面可见排列整齐的单层柱状上皮细胞,药物-纤维蛋白胶呈均质染色,厚度均一,约0.3 mm,胶原纤维呈明显的网状结构。扫描电镜:两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜基底涂胶面呈明显的胶原纤维网状结构,药物附着在各胶原纤维交错构成的三维网状孔隙内,孔径大小不一,直径约6～24μm。实验二:药膜中的纤维蛋白胶在10天内完全降解。随着纤维蛋白胶(fibrin glue, FG)的缓慢降解,两性霉素B从药膜中持续释放,前3天释放量较多,第1、2、3天生理盐水浸出液中两性霉素B浓度分别为59.9μg/ml、34.1μg/ml、27.9μg/ml,累积释放率达30.38 %,以后药物释放逐渐减少并趋于平稳,第10天两性霉素B浓度为0.78μg/ml,仍在最低抑菌浓度范围内。实验三:两性霉素B脂质体组对茄病镰刀菌的MIC范围为1.0～2.0μg/ml,对烟曲霉菌的MIC范围为0.5～2.0μg/ml;药膜浸出液组对茄病镰刀菌的MIC范围为1.5～2.0μg/ml,对烟曲霉菌的MIC范围为0.78～2.0μg/ml。实验四:药膜移植于兔眼表后,纤维蛋白胶缓慢降解,药膜逐渐变薄,到第5天胶全部降解。实验组各时间点房水中均可测出两性霉素B,其中第1、2天房水中两性霉素B分别为113.1 ng/ml、61.2 ng/ml,以后药物浓度逐渐降低并趋于平稳,第5天药物浓度为28.0 ng/ml,但均在最低抑菌浓度范围内,药膜缓释趋势明显可见。对照组每天房水中AmB浓度均维持在稳定水平,平均值为26.1 ng/ml,均在最低抑菌浓度范围内,但浓度相对较低。结论1.两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜可容纳大量的药物,具有稳定的生物物理学性能。2.通过高效液相色谱法显示,随着纤维蛋白胶的溶解,两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜在体外具有缓释作用。3.体外抗真菌药敏结果显示,两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜具有明确的抑菌作用,随着时间的延长,抑菌作用逐渐减弱。4.两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜移植到眼表后,在房水中可检测出两性霉素B浓度,说明该药膜中的药物能缓慢持续释放并渗透到眼内。